एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल टिशू फैक्टर गतिविधि परख
Summary
यहां हम एक इन-हाउस एक्स्ट्रासेलुलर पुटिका ऊतक कारक गतिविधि परख का वर्णन करते हैं। गतिविधि-आधारित परख और प्रतिजन-आधारित assays का उपयोग मानव प्लाज्मा नमूनों से बाह्य पुटिकाओं में ऊतक कारक को मापने के लिए किया गया है। गतिविधि-आधारित परखों में एंटीजन-आधारित परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता होती है।
Abstract
ऊतक कारक (TF) कारक (F) VII और FVIIA के लिए एक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर है। TF/FVIIa कॉम्प्लेक्स FIX और FX दोनों को सक्रिय करके जमावट कैस्केड शुरू करता है। TF को कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं (EVs) के रूप में परिसंचरण में छोड़ा जाता है। टीएफ-पॉजिटिव (+) ईवीएस का स्तर कैंसर, जीवाणु और वायरल संक्रमण, और सिरोसिस सहित विभिन्न बीमारियों में बढ़ जाता है, और घनास्त्रता, प्रसारित इंट्रावास्कुलर जमावट, रोग की गंभीरता और मृत्यु दर से जुड़ा होता है। प्लाज्मा में TF+ EVs को मापने के दो तरीके हैं: एंटीजन- और गतिविधि-आधारित परख। डेटा इंगित करता है कि गतिविधि-आधारित assays में एंटीजन-आधारित assays की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है। यह पत्र दो-चरण एफएक्सए पीढ़ी परख के आधार पर हमारे इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख का वर्णन करता है। FVIIa, FX, और कैल्शियम TF+ EV युक्त नमूनों में जोड़ा जाता है ताकि TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी को TF-स्वतंत्र FXa पीढ़ी से अलग करने के लिए एंटी-TF एंटीबॉडी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में FXa उत्पन्न किया जा सके। एफएक्सए द्वारा क्लीव किए गए एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग एफएक्सए स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जबकि टीएफ एकाग्रता के निर्धारण के लिए एक रिलिपिडेटेड पुनः संयोजक टीएफ के साथ उत्पन्न एक मानक वक्र का उपयोग किया जाता है। इस इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख में वाणिज्यिक टीएफ गतिविधि परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है।
Introduction
रक्त जमावट कारक (F) VII/VIIa से ऊतक कारक (TF)1 के बंधन के साथ शुरू किया जाता है। TF/FVIIa कॉम्प्लेक्स रक्त जमावट को सक्रिय करने के लिए FIX और FX दोनों को सक्रिय करता है1. पूर्ण-लंबाई, झिल्ली-बाध्य TF के दो रूप हैं: एन्क्रिप्टेड और सक्रिय। इसके अलावा, TF (asTF) का एक वैकल्पिक रूप से विभाजित रूप है। कोशिका झिल्ली के बाहरी पत्रक में स्फिंगोमाइलिन और फॉस्फेटिडिलकोलाइन एक एन्क्रिप्टेड अवस्था 2,3,4 में TF बनाए रखते हैं। जब कोशिकाएं सक्रिय या क्षतिग्रस्त हो जाती हैं, तो फॉस्फोलिपिड स्क्रैम्बलेस फॉस्फेटिडाइलेरिन और अन्य नकारात्मक चार्ज फॉस्फोलिपिड्स को बाहरी पत्रक1 में स्थानांतरित करता है। कोशिकाओं की सक्रियता के परिणामस्वरूप एसिड स्फिंगोमाइलिनेज का बाहरी पत्रक में स्थानांतरण होता है जहां यह स्फिंगोमाइलिन को सेरामाइड5 में नीचा दिखाता है। ये दो तंत्र एन्क्रिप्टेड TF को सक्रिय रूप में परिवर्तित करते हैं। यह भी प्रस्तावित है कि प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड आइसोमेरेज़ एन्क्रिप्टेड TF में Cys186 और Cys209 के बीच डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड गठन की मध्यस्थता करता है, जिसके परिणामस्वरूप TF 6,7,8 का डी-एन्क्रिप्शन होता है। asTF भी परिसंचरण में मौजूद है लेकिन ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन का अभाव है और इसलिए घुलनशील 9,10 है। महत्वपूर्ण रूप से, asTF में पूर्ण लंबाई वाले सक्रिय TF10,11 की तुलना में प्रोकोआगुलेंट गतिविधि का स्तर बहुत कम है।
बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) आराम करने, सक्रिय, और मेजबान कोशिकाओं, साथ ही कैंसर कोशिकाओं12 मरने से जारी कर रहे हैं. ईवीएस अपने पैतृक कोशिकाओं से प्रोटीन व्यक्त करते हैं12. सक्रिय टीएफ-असर ईवीएस सक्रिय मोनोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं से परिसंचरण 13,14,15में जारी किए जाते हैं। प्लाज्मा में टीएफ के स्तर को गतिविधि और एंटीजन-आधारित परख द्वारा मापा जा सकता है। एंटीजन आधारित assays एलिसा और प्रवाह cytometry16 शामिल. दो अलग-अलग गतिविधि-आधारित परखें हैं: एक और दो-चरण TF गतिविधि परख। एक चरण परख एक प्लाज्मा आधारित थक्के परख पर आधारित है. TF युक्त नमूने को प्लाज्मा में जोड़ा जाता है और थक्का बनाने का समय पुन: कैल्सीफिकेशन के बाद मापा जाता है। दो-चरण परख FVII या FVIIa, FX और कैल्शियम जोड़कर नमूनों की FXa पीढ़ी को मापता है। एफएक्सए स्तर एक सब्सट्रेट का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है जो एफएक्सए द्वारा क्लीव किया जाता है।
एक और दो चरण TF गतिविधि परख दोनों में, TF एकाग्रता पुनः संयोजक TF के साथ उत्पन्न एक मानक वक्र का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. दो-चरण परख में एक-चरण परख की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता होती है। कई अध्ययनों ने पुष्टि की है कि गतिविधि आधारित assays में एंटीजन-आधारित assays 17,18,19,20,21की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है। इसके अलावा, हमारे घर में गतिविधि परख एक वाणिज्यिक गतिविधि परख22 की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है. स्वस्थ व्यक्तियों में प्लाज्मा में ईवीटीएफ गतिविधि का बहुत कम या ज्ञानी स्तर होता है। इसके विपरीत, कैंसर, सिरोसिस, सेप्सिस और वायरल संक्रमण जैसी पैथोलॉजिकल स्थितियों वाले व्यक्तियों में ईवीटीएफ गतिविधि का पता लगाने योग्य स्तर होता है और यह घनास्त्रता, प्रसारित इंट्रावास्कुलर जमावट, रोग की गंभीरता और मृत्यु दर 23,24,25,26,27,28 से जुड़ा होता है। यहां, हम इस इन-हाउस दो-चरण ईवीटीएफ गतिविधि परख का वर्णन करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमारे इन-हाउस ईवीटीएफ गतिविधि परख का प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं. EV पेलेट का पुनर्गठन करते समय, EV पेलेट के स्थान पर पिपेट को ऊपर और नीचे करना महत्वपूर्ण है, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच NHLBI R35HL155657 द्वारा समर्थित किया गया (एनएम) और जॉन सी. पार्कर प्रोफेसरशिप (एनएम). हम सुश्री सिएरा जे आर्चीबाल्ड को उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं
Materials
| 1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
| 1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
| 15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
| 21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
| 96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
| BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
| Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
| Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
| Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
| Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
| Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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