Ensaio de Atividade do Fator Tecidual da Vesícula Extracelular

Summary

Descrevemos aqui um ensaio in house de atividade do fator tecidual da vesícula extracelular. Ensaios baseados em atividade e ensaios baseados em antígenos têm sido usados para medir o fator tecidual em vesículas extracelulares de amostras de plasma humano. Os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos.

Abstract

O fator tecidual (FT) é um receptor transmembrana para o fator (F) VII e FVIIa. O complexo TF/FVIIa inicia a cascata de coagulação ativando tanto o FIX quanto o FX. O FT é liberado das células para a circulação na forma de vesículas extracelulares (EVs). O nível de EVs TF-positivos (⁺) está aumentado em várias doenças, incluindo câncer, infecções bacterianas e virais e cirrose, e está associado a trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade. Existem duas maneiras de medir os EVs TF⁺ no plasma: ensaios baseados em antígeno e atividade. Os dados indicam que os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos. Este artigo descreve nosso ensaio interno de atividade de EVTF baseado em um ensaio de geração FXa de dois estágios. FVIIa, FX e cálcio são adicionados às amostras contendo TF⁺ EV para gerar FXa na presença e ausência de anticorpo anti-TF para distinguir a geração FXa TF-dependente da geração FXa TF-independente. Um substrato cromogênico clivado por FXa é usado para determinar o nível de FXa, enquanto uma curva padrão gerada com um TF recombinante relipidado é usada para a determinação da concentração de FT. Este ensaio interno de atividade de EVTF tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio comercial de atividade de FT.

Introduction

A coagulação sanguínea é iniciada com a ligação do fator (F) VII/VIIa ao fator tecidual (FT)¹. O complexo TF/FVIIa ativa tanto o FIX quanto o FX para ativar a coagulação sanguínea¹. Existem duas formas de TF completo, ligado à membrana: criptografado e ativo. Além disso, há uma forma alternativamente emendada de FT (asTF). A esfingomielina e a fosfatidilcolina no folheto externo da membrana celular mantêm os FT criptografados ^2,3,4. Quando as células são ativadas ou danificadas, a scramblase fosfolipídica transfere fosfatidilserina e outros fosfolipídios carregados negativamente para o folheto externo¹. A ativação celular também resulta na translocação da esfingomielinase ácida para o folheto externo, onde degrada a esfingomielina em ceramida⁵. Esses dois mecanismos convertem o TF criptografado para a forma ativa. Propõe-se também que a proteína dissulfeto isomerase medeia a formação de ligações dissulfeto entre Cys186 e Cys209 em FT criptografados, o que resulta na descriptografia de FT6,7,8. A ASTF também está presente na circulação, mas não possui o domínio transmembrana e, portanto, é solúvel ^9,10. É importante ressaltar que o TF tem níveis muito baixos de atividade pró-coagulante em comparação com o TF ativo de comprimento total^10,11.

As vesículas extracelulares (EVs) são liberadas das células do hospedeiro em repouso, ativadas e moribundas, bem como das células cancerígenas¹². Os EVs expressam proteínas de suas células parentais¹². Os EVs ativos portadores de FT são liberados de monócitos ativados, células endoteliais e células tumorais para a circulação 13,14,15. Os níveis de FT no plasma podem ser medidos por ensaios baseados em atividade e antígeno. Os ensaios baseados em antígenos incluem ELISA e citometria de fluxo¹⁶. Existem dois ensaios diferentes baseados em atividades: ensaios de atividade de TF de um e dois estágios. O ensaio de um estágio é baseado em um ensaio de coagulação à base de plasma. A amostra contendo TF é adicionada ao plasma e o tempo para formar um coágulo é medido após a recalcificação. O ensaio de dois estágios mede a geração FXa de amostras adicionando FVII ou FVIIa, FX e cálcio. Os níveis de FXa são determinados usando um substrato que é clivado por FXa.

Nos ensaios de atividade de FT em um e dois estágios, a concentração de FT é determinada usando uma curva padrão gerada com FT recombinante. Os ensaios em dois estágios têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios em um estágio. Muitos estudos têm confirmado que ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que ensaios baseados em antígenos17,18,19,20,21. Além disso, nosso ensaio de atividade interna tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio de atividade comercial²². Indivíduos saudáveis têm níveis muito baixos ou indetectáveis de atividade da EVTF no plasma. Em contraste, indivíduos com condições patológicas, como câncer, cirrose, sepse e infecção viral, apresentam níveis detectáveis de atividade da FVE, o que está associado à trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade 23,24,25,26,27,28. Aqui, descreveremos este ensaio interno de atividade de EVTF em dois estágios.

Protocol

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da University of North Carolina at Chapel Hill (número do protocolo: 14-2108). 1. Coleta de sangue de doadores Coletar sangue total usando punção venosa limpa na veia antecubital com uma agulha 21 G. Descarte os primeiros 3 mL de sangue, pois essa porção de sangue pode conter FT das células perivasculares. Extrair 2,7 ou 1,8 ml (dependendo do tamanho dos tubos) de sangue num vacutainer contend…

Representative Results

Um resultado bem-sucedido fornece um valor de controle positivo de ≥0,5 pg/mL e um valor de controle negativo de 1,0 pg/mL EVTF para um controle positivo. O resultado representativo mostra a atividade EVTF de EVs isolados do plasma do sangue total de 11 doadores saudáveis, com e sem ativação do LPS (Figura 4). Seis dos onze doadores (Doadores 2, 4, 5, 8, 10, 11) responderam de médio a alto LPS, enquanto cinco …

Discussion

Aqui, o protocolo do nosso ensaio interno de atividade EVTF é apresentado. Há três etapas críticas no protocolo. Ao reconstituir a pelota de EV, é importante pipetar para cima e para baixo no local da pelota de EV, mesmo que ela não seja visível. A reconstituição incompleta da pastilha de EV resultará em um falso negativo ou subestimação dos valores de atividade de EVTF das amostras. Em segundo lugar, o uso de HBSA-Ca(+) é crítico na etapa 6.5 do protocolo porque a geração FXa não pode ser gerada sem cá…

Materials

1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55