Analys av extracellulär vesikelvävnadsfaktoraktivitet

Summary

Här beskriver vi en intern extracellulär vesikelvävnadsfaktoraktivitetsanalys. Aktivitetsbaserade analyser och antigenbaserade analyser har använts för att mäta vävnadsfaktor i extracellulära vesiklar från humana plasmaprover. Aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser.

Abstract

Vävnadsfaktor (TF) är en transmembranreceptor för faktor (F) VII och FVIIa. TF/FVIIa-komplexet initierar koagulationskaskaden genom att aktivera både FIX och FX. TF frisätts från celler till cirkulationen i form av extracellulära vesiklar (EV). Nivån av TF-positiva (⁺) EV är förhöjda vid olika sjukdomar, inklusive cancer, bakterie- och virusinfektioner och cirros, och är förknippad med trombos, disseminerad intravaskulär koagulation, sjukdomens svårighetsgrad och mortalitet. Det finns två sätt att mäta TF⁺ EV i plasma: antigen- och aktivitetsbaserade analyser. Data tyder på att aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser. Detta dokument beskriver vår interna EVTF-aktivitetsanalys baserad på en tvåstegs FXa-genereringsanalys. FVIIa, FX och kalcium tillsätts till de TF⁺ EV-innehållande proverna för att generera FXa i närvaro och frånvaro av anti-TF-antikroppar för att skilja TF-beroende FXa-generering från TF-oberoende FXa-generering. Ett kromogent substrat klyvt av FXa används för att bestämma FXa-nivån, medan en standardkurva genererad med en relipiderad rekombinant TF används för bestämning av TF-koncentrationen. Denna interna EVTF-aktivitetsanalys har högre sensitivitet och specificitet än en kommersiell TF-aktivitetsanalys.

Introduction

Blodkoagulationen initieras med bindning av faktor (F) VII/VIIa till vävnadsfaktor (TF)¹. TF/FVIIa-komplexet aktiverar både FIX och FX för att aktivera blodkoagulation¹. Det finns två former av membranbunden TF i full längd: krypterad och aktiv. Dessutom finns det en alternativt splitsad form av TF (asTF). Sphingomyelin och fosfatidylkolin i cellmembranets yttre bipacksedel upprätthåller TF i krypterat tillstånd ^2,3,4. När celler aktiveras eller skadas överför fosfolipidförvrängning fosfatidylserin och andra negativt laddade fosfolipider till det yttre bipacksedeln¹. Aktiveringen av celler resulterar också i translokation av surt sfingomyelinas till den yttre bipacksedeln där det bryter ned sfingomyelin till ceramid⁵. Dessa två mekanismer konverterar krypterad TF till den aktiva formen. Det föreslås också att proteindisulfidisomeras medierar disulfidbindningsbildning mellan Cys186 och Cys209 i krypterad TF, vilket resulterar i dekryptering av TF ^6,7,8. asTF finns också i cirkulationen men saknar den transmembrana domänen och är därför löslig ^9,10. Viktigt är att asTF har mycket låga nivåer av prokoagulerande aktivitet jämfört med aktiv TF^10,11 i full längd.

Extracellulära vesiklar (EV) frigörs från vilande, aktiverade och döende värdceller, såväl som cancerceller¹². EV uttrycker proteiner från sina föräldraceller¹². Aktiva TF-bärande EV frisätts från aktiverade monocyter, endotelceller och tumörceller i cirkulationen 13,14,15. Nivåer av TF i plasma kan mätas med aktivitets- och antigenbaserade analyser. Antigenbaserade analyser inkluderar ELISA och flödescytometri¹⁶. Det finns två olika aktivitetsbaserade analyser: enstegs och tvåstegs TF-aktivitetsanalyser. Enstegsanalysen är baserad på en plasmabaserad koagulationsanalys. Det TF-innehållande provet tillsätts till plasma och tiden för att bilda en koagel mäts efter omkalkning. Tvåstegsanalysen mäter FXa-generering av samples genom att tillsätta FVII eller FVIIa, FX och kalcium. FXa-nivåerna bestäms med hjälp av ett substrat som klyvs av FXa.

I både en- och tvåstegs TF-aktivitetsanalyser bestäms TF-koncentrationen med hjälp av en standardkurva genererad med rekombinant TF. Tvåstegsanalyser har högre sensitivitet och specificitet än enstegsanalysen. Många studier har bekräftat att aktivitetsbaserade analyser har högre sensitivitet och specificitet än antigenbaserade analyser 17,18,19,20,21. Dessutom har vår interna aktivitetsanalys högre sensitivitet och specificitet än en kommersiell aktivitetsanalys²². Friska individer har mycket låga eller odetekterbara nivåer av EVTF-aktivitet i plasma. Däremot har individer med patologiska tillstånd, såsom cancer, cirros, sepsis och virusinfektion, detekterbara nivåer av EVTF-aktivitet och detta är associerat med trombos, disseminerad intravaskulär koagulation, sjukdomens svårighetsgrad och dödlighet 23,24,25,26,27,28. Här kommer vi att beskriva denna interna tvåstegs EVTF-aktivitetsanalys.

Protocol

Forskningen godkändes av Institutional Review Board vid University of North Carolina i Chapel Hill (protokollnummer: 14-2108). 1. Insamling av blod från givare Samla upp helblod med ren venpunktion i venen antecubital med en 21 G nål. Kassera de första 3 ml blod eftersom denna del av blodet kan innehålla TF från perivaskulära celler. Dra upp 2,7 eller 1,8 ml (beroende på rörens storlek) blod i en vakuum som innehåller 3,2 % natriumcitrat (0,109 mo…

Representative Results

Ett lyckat resultat ger ett positivt kontrollvärde på ≥0,5 pg/ml och ett negativt kontrollvärde på 1.0 pg/ml EVTF-aktivitet för en positiv kontroll. Det representativa resultatet visar EVTF-aktiviteten hos EV isolerade från plasma från helblod från 11 friska donatorer, med och utan LPS-aktivering (Figur 4). Sex av elva donatorer (donator 2, 4, 5, 8, 10, 11) svarade medelhögt till mycket LPS, medan fem av elva donatorer…

Discussion

Här presenteras protokollet för vår interna EVTF-aktivitetsanalys. Det finns tre kritiska steg i protokollet. Vid beredning av EV-pelleten, det är viktigt att pipettera upp och ner på platsen för EV-pelleten även om den inte är synlig. Ofullständig beredning av EV-pelleten kommer att resultera i ett falskt negativt eller underskattning av EVTF-aktivitetsvärdena för proverna. För det andra är det viktigt att använda HBSA-Ca(+) i protokollsteg 6.5 eftersom FXa-generering inte kan genereras utan kalcium. För …

Materials

1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge	any company	N/A	We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifuge	any company	N/A	We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tube	any company	N/A	We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter	BD	367281
96-well plate	any company	N/A	We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate Tubes	BD	363083
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A9418
Calcium chloride	Fisher Scientific	C69-500
Centrifuge for 1.5 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tube	any company	N/A	We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Human FVIIa	Enzyme Research Laboratory	HFVIIa	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4	Sigma Aldrich	L2630	There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Enzyme Research Laboratory	085-27
Plate reader	any company	N/A	We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin	Siemens	10873566
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima TLX
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	TLA-55