Burada kurum içi hücre dışı vezikül dokusu faktör aktivite testini açıklıyoruz. İnsan plazma örneklerinden hücre dışı veziküllerdeki doku faktörünü ölçmek için aktiviteye dayalı testler ve antijen bazlı testler kullanılmıştır. Aktiviteye dayalı tahliller, antijen bazlı tahlillere göre daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.
Doku faktörü (TF), faktör (F) VII ve FVIIa için bir transmembran reseptörüdür. TF/FVIIa kompleksi, hem FIX hem de FX’i etkinleştirerek pıhtılaşma kademesini başlatır. TF, hücrelerden hücre dışı veziküller (EV’ler) şeklinde dolaşıma salınır. Kanser, bakteriyel ve viral enfeksiyonlar ve siroz dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda TF pozitif (+) EV’lerin seviyesi artar ve tromboz, yaygın damar içi pıhtılaşma, hastalık şiddeti ve mortalite ile ilişkilidir. Plazmada TF+ EV’leri ölçmenin iki yolu vardır: antijen ve aktivite bazlı tahliller. Veriler, aktivite bazlı testlerin antijen bazlı testlerden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olduğunu göstermektedir. Bu makale, iki aşamalı bir FXa üretim testine dayanan kurum içi EVTF aktivite testimizi açıklamaktadır. TF’ye bağımlı FXa neslini TF’den bağımsız FXa neslinden ayırt etmek için anti-TF antikorunun varlığında ve yokluğunda FXa oluşturmak için TF+ EV içeren numunelere FVIIa, FX ve kalsiyum eklenir. FXa seviyesini belirlemek için FXa tarafından parçalanmış bir kromojenik substrat kullanılırken, TF konsantrasyonunun belirlenmesi için relipidlenmiş bir rekombinant TF ile oluşturulan standart bir eğri kullanılır. Bu kurum içi EVTF aktivite testi, ticari bir TF aktivite testinden daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahiptir.
Faktör (F) VII/VIIa’nın doku faktörüne (TF)1 bağlanması ile kan pıhtılaşması başlatılır. TF / FVIIa kompleksi, kan pıhtılaşmasını etkinleştirmek için hem FIX hem de FX’i aktive eder1. Tam uzunlukta, membrana bağlı TF’nin iki biçimi vardır: şifreli ve aktif. Ek olarak, alternatif olarak eklenmiş bir TF formu (asTF) vardır. Hücre zarının dış broşüründeki sfingomyelin ve fosfatidilkolin, TF’yi şifreli bir durumdatutar 2,3,4. Hücreler aktive edildiğinde veya hasar gördüğünde, fosfolipid scramblase, fosfatidilserin ve diğer negatif yüklü fosfolipidleri dış broşüre1 aktarır. Hücrelerin aktivasyonu ayrıca asit sfingomiyelinazın dış broşüre translokasyonu ile sonuçlanır ve burada sfingomyelini seramid5’e indirger. Bu iki mekanizma şifreli TF’yi aktif forma dönüştürür. Ayrıca, protein disülfid izomerazın, şifreli TF’de Cys186 ve Cys209 arasında disülfid bağı oluşumuna aracılık ettiği ve bunun da TF 6,7,8’in şifresinin çözülmesine neden olduğu öne sürülmektedir. asTF de dolaşımda bulunur ancak transmembran alanından yoksundur ve bu nedenle çözünür 9,10. Daha da önemlisi, asTF, tam uzunlukta aktif TF10,11’e kıyasla çok düşük prokoagülan aktivite seviyelerine sahiptir.
Hücre dışı veziküller (EV’ler) dinlenen, aktive olan ve ölmekte olan konakçı hücrelerin yanı sıra kanser hücrelerindensalınır 12. EV’ler proteinleri ebeveyn hücrelerinden eksprese eder12. Aktif TF taşıyan EV’ler, aktive edilmiş monositlerden, endotel hücrelerinden ve tümör hücrelerinden dolaşımasalınır 13,14,15. Plazmadaki TF seviyeleri, aktivite ve antijen bazlı tahlillerle ölçülebilir. Antijen bazlı testler arasında ELISA ve akış sitometrisi16 bulunur. İki farklı aktivite tabanlı tahlil vardır: bir ve iki aşamalı TF aktivite tahlilleri. Tek aşamalı tahlil, plazma bazlı bir pıhtılaşma tahliline dayanır. TF içeren numune plazmaya eklenir ve yeniden kalsifikasyondan sonra pıhtı oluşturma süresi ölçülür. İki aşamalı tahlil, FVII veya FVIIa, FX ve kalsiyum ekleyerek FXa numune neslini ölçer. FXa seviyeleri, FXa tarafından parçalanmış bir substrat kullanılarak belirlenir.
Hem bir hem de iki aşamalı TF aktivite testlerinde, TF konsantrasyonu, rekombinant TF ile oluşturulan standart bir eğri kullanılarak belirlenir. İki aşamalı tahliller, tek aşamalı tahlilden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Birçok çalışma, aktiviteye dayalı testlerin antijen bazlı testlerden daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olduğunu doğrulamıştır 17,18,19,20,21. Ek olarak, kurum içi faaliyet tahlili, ticari faaliyet tahlilinden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir22. Sağlıklı bireyler, plazmada çok düşük veya tespit edilemeyen EVTF aktivitesine sahiptir. Buna karşılık, kanser, siroz, sepsis ve viral enfeksiyon gibi patolojik rahatsızlıkları olan bireyler, saptanabilir düzeyde EVTF aktivitesine sahiptir ve bu, tromboz, yaygın damar içi pıhtılaşma, hastalık şiddeti ve mortalite ile ilişkilidir 23,24,25,26,27,28. Burada, bu kurum içi iki aşamalı EVTF aktivite tahlilini açıklayacağız.
Burada, kurum içi EVTF aktivite testimizin protokolü sunulmaktadır. Protokolde üç kritik adım vardır. EV peletini sulandırırken, görünür olmasa bile EV peletinin bulunduğu yerde yukarı ve aşağı pipetlemek önemlidir. EV peletinin eksik sulandırılması, numunelerin EVTF aktivite değerlerinin yanlış negatif veya eksik tahmin edilmesine neden olacaktır. İkinci olarak, HBSA-Ca(+) kullanmak protokol adımı 6.5’te kritik öneme sahiptir, çünkü FXa üretimi kalsiyum olmadan oluşturulamaz. Üçüncü…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ve John C. Parker profesörlüğü (N.M.) tarafından desteklenmiştir. Yararlı yorumları için Bayan Sierra J. Archibald’a teşekkür ederiz
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |