Her beskriver vi en intern ekstracellulær vesikelvævsfaktoraktivitetsanalyse. Aktivitetsbaserede assays og antigenbaserede assays er blevet anvendt til at måle vævsfaktor i ekstracellulære vesikler fra humane plasmaprøver. Aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays.
Vævsfaktor (TF) er en transmembranreceptor for faktor (F) VII og FVIIa. TF/FVIIa-komplekset initierer koagulationskaskaden ved at aktivere både FIX og FX. TF frigives fra celler til cirkulationen i form af ekstracellulære vesikler (EV’er). Niveauet af TF-positive (+) EV’er øges i forskellige sygdomme, herunder kræft, bakterielle og virale infektioner og skrumpelever, og er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdommens sværhedsgrad og dødelighed. Der er to måder at måle TF+ EV’er i plasma: antigen- og aktivitetsbaserede assays. Data indikerer, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays. Dette papir beskriver vores interne EVTF-aktivitetsanalyse baseret på et to-trins FXa-generationsassay. FVIIa, FX og calcium tilsættes til TF+ EV-holdige prøver for at generere FXa i nærvær og fravær af anti-TF-antistof for at skelne TF-afhængig FXa-generering fra TF-uafhængig FXa-generation. Et kromogent substrat spaltet af FXa anvendes til at bestemme FXa-niveauet, mens en standardkurve genereret med en relipideret rekombinant TF anvendes til bestemmelse af TF-koncentrationen. Denne interne EVTF-aktivitetsanalyse har højere følsomhed og specificitet end et kommercielt TF-aktivitetsassay.
Blodkoagulation initieres med binding af faktor (F) VII/VIIa til vævsfaktor (TF)1. TF / FVIIa-komplekset aktiverer både FIX og FX for at aktivere blodkoagulation1. Der er to former for membranbundet TF i fuld længde: krypteret og aktiv. Derudover er der en alternativt splejset form af TF (asTF). Sphingomyelin og phosphatidylcholin i cellemembranens ydre folder opretholder TF i krypteret tilstand 2,3,4. Når celler aktiveres eller beskadiges, overfører phospholipidscramblase phosphatidylserin og andre negativt ladede phospholipider til den ydre folder1. Aktiveringen af celler resulterer også i translokation af sur sphingomyelinase til den ydre folder, hvor den nedbryder sphingomyelin til ceramid5. Disse to mekanismer konverterer krypteret TF til den aktive form. Det foreslås også, at proteindisulfidisomerase medierer disulfidbindingsdannelse mellem Cys186 og Cys209 i krypteret TF, hvilket resulterer i dekryptering af TF 6,7,8. asTF er også til stede i cirkulationen, men mangler transmembrandomænet og er derfor opløseligt 9,10. Det er vigtigt, at asTF har meget lave niveauer af prokoagulerende aktivitet sammenlignet med aktiv TF10,11 i fuld længde.
Ekstracellulære vesikler (EV’er) frigives fra hvilende, aktiverede og døende værtsceller samt kræftceller12. Elbiler udtrykker proteiner fra deres forældreceller12. Aktive TF-bærende EV’er frigives fra aktiverede monocytter, endotelceller og tumorceller i cirkulationen 13,14,15. Niveauer af TF i plasma kan måles ved aktivitets- og antigenbaserede assays. Antigenbaserede assays inkluderer ELISA og flowcytometri16. Der er to forskellige aktivitetsbaserede assays: et- og to-trins TF-aktivitetsassays. Ettrinsanalysen er baseret på et plasmabaseret koagulationsassay. Den TF-holdige prøve tilsættes til plasma, og tiden til dannelse af en koagulation måles efter genforkalkning. To-trins analysen måler FXa-generering af prøver ved at tilføje FVII eller FVIIa, FX og calcium. FXa-niveauer bestemmes ved hjælp af et substrat, der spaltes af FXa.
I både et- og totrins TF-aktivitetsassays bestemmes TF-koncentrationen ved hjælp af en standardkurve genereret med rekombinant TF. To-trins assays har højere følsomhed og specificitet end et-trins assayet. Mange undersøgelser har bekræftet, at aktivitetsbaserede assays har højere følsomhed og specificitet end antigenbaserede assays 17,18,19,20,21. Derudover har vores interne aktivitetsanalyse højere følsomhed og specificitet end et kommercielt aktivitetsassay22. Raske individer har meget lave eller uopdagelige niveauer af EVTF-aktivitet i plasma. I modsætning hertil har personer med patologiske tilstande, såsom kræft, skrumpelever, sepsis og virusinfektion, påviselige niveauer af EVTF-aktivitet, og dette er forbundet med trombose, dissemineret intravaskulær koagulation, sygdomssværhedsgrad og dødelighed 23,24,25,26,27,28. Her vil vi beskrive dette interne to-trins EVTF-aktivitetsassay.
Her præsenteres protokollen for vores interne EVTF-aktivitetsanalyse. Der er tre kritiske trin i protokollen. Ved rekonstituering af EV-pillen er det vigtigt at pipette op og ned på EV-pelletens placering, selvom den ikke er synlig. Ufuldstændig rekonstitution af EV-pelleten vil resultere i en falsk negativ eller undervurdering af EVTF-aktivitetsværdier for prøverne. For det andet er brug af HBSA-Ca (+) kritisk i protokoltrin 6.5, fordi FXa-generering ikke kan genereres uden calcium. For det tredje er det afgørende…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) og John C. Parker professoratet (N.M.). Vi vil gerne takke fru Sierra J. Archibald for hendes nyttige kommentarer
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |