Kemisk affinitetsbaseret isolering af ekstracellulære vesikler fra biofluider til proteomics og phosphoproteomics analyse

Summary

Denne protokol indeholder detaljerede beskrivelser for effektiv isolering af ekstracellulære vesikler i urinen ved hjælp af funktionaliserede magnetiske perler. Desuden omfatter det efterfølgende analyser, herunder western blotting, proteomics og phosphoproteomics.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV’er) fra biofluider har for nylig fået betydelig opmærksomhed inden for flydende biopsi. Frigivet af næsten alle typer celler, giver de et realtidsbillede af værtsceller og indeholder et væld af molekylær information, herunder proteiner, især dem med posttranslationelle modifikationer (PTM’er) såsom phosphorylering, som hovedaktøren i cellulære funktioner og sygdomsdebut og progression. Imidlertid er isoleringen af elbiler fra biofluider fortsat udfordrende på grund af lave udbytter og urenheder fra de nuværende EV-isoleringsmetoder, hvilket gør downstream-analysen af EV-last, såsom EV-phosphoproteiner, vanskelig. Her beskriver vi en hurtig og effektiv EV-isoleringsmetode baseret på funktionaliserede magnetiske perler til EV-isolering fra biofluider såsom human urin og nedstrøms proteomics og phosphoproteomics analyse efter EV-isolering. Protokollen muliggjorde et højt genvindingsudbytte af urin-EV’er og følsomme profiler af EV-proteom og phosphoproteom. Desuden behandles denne protokols alsidighed og relevante tekniske overvejelser også her.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV’er) er membranindkapslede nanopartikler, der udskilles af alle typer celler og er til stede i biofluider såsom blod, urin, spyt osv.1,2,3,4. EV’er bærer en last af forskellige bioaktive molekyler, der afspejler deres værtscellers fysiologiske og patologiske tilstand og derfor fungerer som afgørende faktorer i sygdomsprogression ^4,5,6. Desuden har omfattende undersøgelser fastslået, at EV-baserede sygdomsmarkører kan identificeres før symptomdebut eller fysiologisk påvisning af tumorer ^5,6,7.

Fosforylering fungerer som en nøglemekanisme i cellulær signalering og regulering. Derfor giver phosphoproteiner en værdifuld kilde til opdagelse af biomarkører, da afvigende fosforyleringshændelser er forbundet med dysregulerede cellulære signalveje og metastatisk sygdomsudvikling såsom kræft ^8,9,10. Selvom profilering af fosforyleringsdynamik gør det muligt at identificere sygdomsspecifikke phosphoproteinsignaturer som potentielle biomarkører, udgør phosphoproteiners lave forekomst og dynamiske natur store udfordringer i udviklingen af phosphoproteiner som biomarkører^11,12. Især er de fosfoproteiner med lavt rigelige mængder, der er indkapslet i EV’er, beskyttet mod ekstern enzymatisk fordøjelse i det ekstracellulære miljø⁸. Derfor tilbyder EV’er og EV-afledte phosphoproteiner en ideel kilde til biomarkøropdagelse i den tidlige fase af påvisning af kræft og andre sygdomme.

Selvom analyse af proteinfosforylering i elbiler giver en værdifuld ressource til forståelse af kræftsignalering og tidlig sygdomsdiagnose, udgør manglen på effektive EV-isoleringsmetoder en stor barriere. EV-isolering opnås almindeligvis gennem differentiel ultracentrifugering (DUC)¹³. Denne metode er imidlertid tidskrævende og er ikke egnet til kliniske implikationer på grund af lav gennemstrømning og dårlig reproducerbarhed^13,14. Alternative EV-isolationsmetoder, såsom polymerinduceret udfældning¹⁵, er begrænset af lav specificitet på grund af samtidig udfældning af ikke-EV-proteiner. Affinitetsbaserede tilgange, herunder antistofbaseret affinitetsregistrering¹⁶ og affinitetsfiltrering¹⁷, tilbyder forbedret specificitet, men er begrænset til en relativt lav genoprettelsesrate på grund af lille volumen.

For at løse problemerne med at udforske fosfoproteindynamik i EV’er har vores gruppe udviklet ekstracellulære vesikler total recovery and purification (EVtrap) teknik baseret på kemisk affinitet til at fange EV’er på funktionaliserede magnetiske perler¹⁸. Tidligere resultater har vist, at denne magnetiske perlebaserede EV-isoleringsmetode er yderst effektiv til isolering af elbiler fra en lang række biofluidprøver og er i stand til at opnå meget højere EV-udbytte, samtidig med at forurening minimeres sammenlignet med DUC og andre eksisterende isolationsmetoder^18,19. Vi har med succes brugt EVtrap og en titaniumbaseret phosphopeptidberigelsesmetode udviklet af vores gruppe²⁰ til at profilere phosphoproteomet af EV’er afledt af forskellige biofluider og til at detektere potentielle phosphoproteinbiomarkører for forskellige sygdomme 19,21,22.

Her præsenterer vi en protokol baseret på EVtrap til isolering af cirkulerende elbiler. Protokollen fokuserer på urin EV’er. Vi demonstrerer også karakteriseringen af isolerede elbiler ved hjælp af western blotting. Vi beskriver derefter prøveforberedelsen og massespektrometri (MS) erhvervelsen til både proteomics og phosphoproteomics analyser. Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar arbejdsgang til profilering af EV-proteomet og phosphoproteomet i urinen, hvilket vil lette yderligere undersøgelser af EV’er og deres kliniske anvendelser²³.

Protocol

Alle urinprøver blev indsamlet fra raske personer efter informeret samtykke. Eksperimenterne var i overensstemmelse med alle etiske standarder, der involverede menneskelige prøver og var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Purdue University Human Research Protection Program. 1. Indsamling af prøver Der centrifugeres 12 ml urinprøve i et 15 ml konisk centrifugerør i 10 minutter ved 2.500 x g, 4 °C for at fjerne cellerester og store apoptotiske l…

Representative Results

Denne protokol demonstrerer en omfattende arbejdsgang fra isolering af elbiler til downstream-proteomics og phosphoproteomics-analyser (figur 1). De tredobbelte urinprøver blev udsat for EV-isolering. De isolerede EV’er blev karakteriseret ved western blotting og efterfølgende behandlet til massespektrometribaseret proteomics prøveforberedelse, herunder proteinekstraktion, enzymatisk fordøjelse og peptidoprydning. Til phosphoproteomics-analyse blev phosphopeptiderne yderligere beriget ba…

Discussion

Effektiv EV-isolering er en væsentlig forudsætning for at detektere proteiner og phosphoproteiner med lav overflod i elbiler. På trods af udviklingen af adskillige metoder til at opfylde dette behov lider flertallet stadig af begrænsninger som dårlig genopretning eller lav reproducerbarhed, hvilket hæmmer deres anvendelse i store undersøgelser og rutinemæssige kliniske indstillinger. DUC betragtes generelt som den mest almindelige metode til EV-isolering, og de ekstra vasketrin anvendes normalt for at hjælpe med…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007