Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Summary

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Bioflüssigkeiten haben in jüngster Zeit im Bereich der Flüssigbiopsie große Aufmerksamkeit erlangt. Sie werden von fast allen Zelltypen freigesetzt, liefern eine Echtzeit-Momentaufnahme der Wirtszellen und enthalten eine Fülle molekularer Informationen, darunter Proteine, insbesondere solche mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, als Hauptakteur der zellulären Funktionen und des Ausbruchs und Fortschreitens von Krankheiten. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Bioflüssigkeiten ist jedoch aufgrund der geringen Ausbeuten und Verunreinigungen der derzeitigen Isolationsmethoden für Elektrofahrzeuge nach wie vor eine Herausforderung, was die nachgelagerte Analyse von EV-Fracht, wie z. B. EV-Phosphoproteinen, erschwert. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive EV-Isolierungsmethode, die auf funktionalisierten magnetischen Beads für die EV-Isolierung aus Bioflüssigkeiten wie menschlichem Urin und der nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse nach der EV-Isolierung basiert. Das Protokoll ermöglichte eine hohe Rückgewinnungsausbeute von EVs im Urin und empfindliche Profile des EV-Proteoms und Phosphoproteoms. Darüber hinaus werden hier auch auf die Vielseitigkeit dieses Protokolls und relevante technische Überlegungen eingegangen.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranverkapselte Nanopartikel, die von allen Arten von Zellen abgesondert werden und in Bioflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel usw. vorhanden sind.1,2,3,4. EVs tragen eine Ladung verschiedener bioaktiver Moleküle, die den physiologischen und pathologischen Zustand ihrer Wirtszellen widerspiegeln und daher als entscheidende Faktoren für das Fortschreiten der Krankheit fungieren ^4,5,6. Darüber hinaus haben umfangreiche Studien gezeigt, dass EV-basierte Krankheitsmarker vor dem Auftreten von Symptomen oder der physiologischen Erkennung von Tumoren identifiziert werden können ^5,6,7.

Die Phosphorylierung ist ein Schlüsselmechanismus für die zelluläre Signalübertragung und Regulation. Daher stellen Phosphoproteine eine wertvolle Quelle für die Entdeckung von Biomarkern dar, da aberrante Phosphorylierungsereignisse mit dysregulierten zellulären Signalwegen und der Entwicklung metastasierender Krankheiten wie Krebs verbunden sind ^8,9,10. Obwohl die Profilierung der Phosphorylierungsdynamik die Identifizierung krankheitsspezifischer Phosphoproteinsignaturen als potenzielle Biomarker ermöglicht, stellen die geringe Häufigkeit und die dynamische Natur von Phosphoproteinen große Herausforderungen bei der Entwicklung von Phosphoproteinen als Biomarker dar^11,12. Bemerkenswert ist, dass die in EVs eingekapselten Phosphoproteine mit geringer Häufigkeit vor externer enzymatischer Verdauung in der extrazellulären Umgebung geschützt sind⁸. Folglich bieten EVs und EV-abgeleitete Phosphoproteine eine ideale Quelle für die Entdeckung von Biomarkern in der Früherkennung von Krebs und anderen Krankheiten.

Obwohl die Analyse der Proteinphosphorylierung in EVs eine wertvolle Ressource für das Verständnis von Krebssignalen und die Diagnose von Krankheiten im Frühstadium darstellt, stellt der Mangel an effizienten Methoden zur Isolierung von EVs ein großes Hindernis dar. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen wird in der Regel durch differentielle Ultrazentrifugation (DUC)¹³ erreicht. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und aufgrund des geringen Durchsatzes und der schlechten Reproduzierbarkeit nicht für klinische Implikationen geeignet^13,14. Alternative EV-Isolierungsansätze, wie z. B. die polymerinduzierte Fällung¹⁵, sind durch eine geringe Spezifität aufgrund der Co-Präzipitation von Nicht-EV-Proteinen begrenzt. Affinitätsbasierte Ansätze, einschließlich Antikörper-basierter Affinitätserfassung¹⁶ und Affinitätsfiltration¹⁷, bieten eine verbesserte Spezifität, sind aber aufgrund des geringen Volumens auf eine relativ niedrige Wiederfindungsrate beschränkt.

Um die Probleme bei der Erforschung der Phosphoproteindynamik in EVs anzugehen, hat unsere Gruppe extrazelluläre Vesikel-Total-Recovery- und Reinigungstechniken (EVtrap) entwickelt, die auf chemischer Affinität basieren, um EVs auf funktionalisierten magnetischen Kügelchen einzufangen¹⁸. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass diese auf magnetischen Kügelchen basierende EV-Isolationsmethode bei der Isolierung von EVs aus einer Vielzahl von Bioflüssigkeitsproben sehr effektiv ist und im Vergleich zu DUC und anderen bestehenden Isolationsmethoden in der Lage ist, eine viel höhere EV-Ausbeute bei gleichzeitiger Minimierung der Kontamination zu erzielen^18,19. Wir haben EVtrap und eine von unserer Gruppe²⁰ entwickelte Methode zur Anreicherung von Phosphopeptiden auf Titanbasis erfolgreich eingesetzt, um das Phosphoproteom von EVs aus verschiedenen Bioflüssigkeiten zu profilieren und potenzielle Phosphoprotein-Biomarker für verschiedene Krankheiten zu erkennen 19,21,22.

Hier stellen wir ein auf EVtrap basierendes Protokoll zur Isolierung von zirkulierenden Elektrofahrzeugen vor. Das Protokoll konzentriert sich auf die EVs im Urin. Wir demonstrieren auch die Charakterisierung isolierter Elektrofahrzeuge mittels Western Blotting. Anschließend beschreiben wir die Probenvorbereitung und die Massenspektrometrie (MS)-Erfassung sowohl für Proteomik- als auch für Phosphoproteomik-Analysen. Dieses Protokoll bietet einen effizienten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Profilierung des EV-Proteoms und Phosphoproteoms im Urin, was weitere Studien zu EVs und ihren klinischen Anwendungen erleichtern^{wird 23}.

Protocol

Alle Urinproben wurden von gesunden Probanden nach Einverständniserklärung entnommen. Die Experimente entsprachen allen ethischen Standards mit menschlichen Proben und den Richtlinien des Purdue University Human Research Protection Program. 1. Probenentnahme Zentrifugieren Sie 12 ml Urinprobe in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 2.500 x g, 4 °C, um Zelltrümmer und große apoptotische Körper zu entfernen. 10 ml des …

Representative Results

Dieses Protokoll demonstriert einen umfassenden Arbeitsablauf von der Isolierung von EVs bis hin zu nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen (Abbildung 1). Die dreifachen Urinproben wurden einer EV-Isolierung unterzogen. Die isolierten EVs wurden mittels Western Blot charakterisiert und anschließend für die massenspektrometriebasierte Proteomik-Probenvorbereitung einschließlich Proteinextraktion, enzymatischer Verdauung und Peptidaufreinigung verarbeitet. Für die Phospho…

Discussion

Eine effektive EV-Isolierung ist eine wesentliche Voraussetzung für den Nachweis von Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs. Trotz der Entwicklung zahlreicher Methoden, um diesen Bedarf zu decken, leidet die Mehrheit immer noch unter Einschränkungen wie schlechter Erholung oder geringer Reproduzierbarkeit, die ihren Einsatz in groß angelegten Studien und klinischen Routineumgebungen behindern. DUC wird im Allgemeinen als die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen angesehe…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007