Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) aus Bioflüssigkeiten haben in jüngster Zeit im Bereich der Flüssigbiopsie große Aufmerksamkeit erlangt. Sie werden von fast allen Zelltypen freigesetzt, liefern eine Echtzeit-Momentaufnahme der Wirtszellen und enthalten eine Fülle molekularer Informationen, darunter Proteine, insbesondere solche mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, als Hauptakteur der zellulären Funktionen und des Ausbruchs und Fortschreitens von Krankheiten. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Bioflüssigkeiten ist jedoch aufgrund der geringen Ausbeuten und Verunreinigungen der derzeitigen Isolationsmethoden für Elektrofahrzeuge nach wie vor eine Herausforderung, was die nachgelagerte Analyse von EV-Fracht, wie z. B. EV-Phosphoproteinen, erschwert. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive EV-Isolierungsmethode, die auf funktionalisierten magnetischen Beads für die EV-Isolierung aus Bioflüssigkeiten wie menschlichem Urin und der nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse nach der EV-Isolierung basiert. Das Protokoll ermöglichte eine hohe Rückgewinnungsausbeute von EVs im Urin und empfindliche Profile des EV-Proteoms und Phosphoproteoms. Darüber hinaus werden hier auch auf die Vielseitigkeit dieses Protokolls und relevante technische Überlegungen eingegangen.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranverkapselte Nanopartikel, die von allen Arten von Zellen abgesondert werden und in Bioflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel usw. vorhanden sind.1,2,3,4. EVs tragen eine Ladung verschiedener bioaktiver Moleküle, die den physiologischen und pathologischen Zustand ihrer Wirtszellen widerspiegeln und daher als entscheidende Faktoren für das Fortschreiten der Krankheit fungieren ^4,5,6. Darüber hinaus haben umfang....

Protokoll

Alle Urinproben wurden von gesunden Probanden nach Einverständniserklärung entnommen. Die Experimente entsprachen allen ethischen Standards mit menschlichen Proben und den Richtlinien des Purdue University Human Research Protection Program.

1. Probenentnahme

1. Zentrifugieren Sie 12 ml Urinprobe in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen für 10 Minuten bei 2.500 x g, 4 °C, um Zelltrümmer und große apoptotische Körper zu entfernen.
2. 10 ml des Überstandes in ein neues 15-ml-Röhrchen überführen und mit der EV-Isolierung fortfahren.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, und die Proben k....

Ergebnisse

Dieses Protokoll demonstriert einen umfassenden Arbeitsablauf von der Isolierung von EVs bis hin zu nachgeschalteten Proteomik- und Phosphoproteomik-Analysen (Abbildung 1). Die dreifachen Urinproben wurden einer EV-Isolierung unterzogen. Die isolierten EVs wurden mittels Western Blot charakterisiert und anschließend für die massenspektrometriebasierte Proteomik-Probenvorbereitung einschließlich Proteinextraktion, enzymatischer Verdauung und Peptidaufreinigung verarbeitet. Für die Phosphoprot.......

Diskussion

Eine effektive EV-Isolierung ist eine wesentliche Voraussetzung für den Nachweis von Proteinen und Phosphoproteinen mit geringer Häufigkeit in EVs. Trotz der Entwicklung zahlreicher Methoden, um diesen Bedarf zu decken, leidet die Mehrheit immer noch unter Einschränkungen wie schlechter Erholung oder geringer Reproduzierbarkeit, die ihren Einsatz in groß angelegten Studien und klinischen Routineumgebungen behindern. DUC wird im Allgemeinen als die gebräuchlichste Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen angesehen, un.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Life Science Products	M-1700C-LB
1,5 mL Röhrchen Magnetabscheidergestell	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL konisches Zentrifugenröhrchen	Corning
15-ml-Röhrchen-Magnetabscheidergestell	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpfte	Antikörper-Zellsignaltechnologie	7074P2
Tischschüttler mit Inkubation	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mischblock MB-101
CD9 (D3H4P) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie		13403S
Chloracetamid	Sigma-Aldrich	C0267-100G	Wird zur Alkylierung von reduzierten Sulfidgruppen verwendet. 400 mM in Wasser als Stammlösung frisch zubereiten.
Ethylacetat	Fisher Wissenschaftlich	E145-4	Fällt Reinigungsmittel
Evosep One	Evosep		Flüssigchromatographie-System
Evotips	Evosep	EV2013	Probenbeladung für Evosep One System
EVtrap	Tymora Analytical		Funktionalisierte magnetische Kügelchen, Ladepuffer und Waschpuffer
Immobilon-FL PVDF-Membran	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting-Membran
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 bis 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Probenpuffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9	Bruker	1893473	Trennsäule
Phosphatase-Inhibitor Cocktail 2	Sigma-Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase-Inhibitor.
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase-Hemmer.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrat	ThermoFisher	32106	HRP Substrat
PolyMAC Phosphopeptid-Anreicherungskit	Tymora Analytical		Polymer-based Metallionen-Affinitätserfassung (PolyMAC) für die Phosphopeptid-Anreicherung
Natriumdesoxycholat	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Reinigungsmittel für Lysepuffer. Bereiten Sie 120 mM in Wasser als Stammlösung vor.
Natriumlauroylsarkosinat	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Reinigungsmittel für Lysepuffer. Bereiten Sie 120 mM in Wasser als Stammlösung vor.
timsTOF HT	Bruker		Ionen-Mobilität Flugzeit-Massenspektrometrie mit gefangenen
Ionen TopTip C-18 (10-200 μ L) Tipps	Glygen	TT2C18.96	Entsalzungsmethode
Triethylamin	Sigma -Aldrich	471283-100ML	Für die EV-Elution.
Triethylammoniumbicabonat-Puffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoressigsäure	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid	Sigma -Aldrich	C4706	Wird zur Reduktion von Disulfidbindungen verwendet. Bereiten Sie 200 mM in Wasser als Stammlösung vor. Aliquotieren Sie die Stammlösung in ein kleines Volumen und lagern Sie sie bei -20 Grad; C (mehrfache Frost-Tau-Zyklen vermeiden).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007

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