Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche

Summary

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l’isolamento efficiente delle vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsfere magnetiche funzionalizzate. Inoltre, comprende analisi successive, tra cui western blotting, proteomica e fosfoproteomica.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) dei biofluidi hanno recentemente guadagnato un’attenzione significativa nel campo della biopsia liquida. Rilasciati da quasi tutti i tipi di cellule, forniscono un’istantanea in tempo reale delle cellule ospiti e contengono una grande quantità di informazioni molecolari, comprese le proteine, in particolare quelle con modificazioni post-traduzionali (PTM) come la fosforilazione, come principale attore delle funzioni cellulari e dell’insorgenza e progressione della malattia. Tuttavia, l’isolamento delle vescicole extracellulari dai biofluidi rimane impegnativo a causa delle basse rese e delle impurità degli attuali metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, rendendo difficile l’analisi a valle del carico di vescicole extracellulari, come le fosfoproteine delle vescicole extracellulari. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento rapido ed efficace delle EV basato su microsfere magnetiche funzionalizzate per l’isolamento delle EV da biofluidi come l’urina umana e l’analisi della proteomica e della fosfoproteomica a valle dopo l’isolamento delle vescicole extracellulari. Il protocollo ha consentito un’elevata resa di recupero delle vescicole extracellulari urinarie e dei profili sensibili del proteoma e del fosfoproteoma delle vescicole extracellulari. Inoltre, in questa sede vengono affrontate anche la versatilità di questo protocollo e le relative considerazioni tecniche.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle incapsulate nella membrana secrete da tutti i tipi di cellule e sono presenti in biofluidi come sangue, urina, saliva, ecc.1,2,3,4. Le vescicole extracellulari trasportano un carico di diverse molecole bioattive che riflettono lo stato fisiologico e patologico delle loro cellule ospiti e, quindi, funzionano come fattori cruciali nella progressione della malattia ^4,5,6. Inoltre, studi approfonditi hanno stabilito che i marcatori di malattia basati sulle vescicole extracellulari possono essere identificati prima dell’insorgenza dei sintomi o del rilevamento fisiologico dei tumori ^5,6,7.

La fosforilazione agisce come un meccanismo chiave nella segnalazione e nella regolazione cellulare. Pertanto, le fosfoproteine forniscono una fonte preziosa per la scoperta di biomarcatori poiché eventi di fosforilazione aberranti sono associati a vie di segnalazione cellulare disregolate e allo sviluppo di malattie metastatiche come il cancro ^8,9,10. Sebbene la profilazione delle dinamiche di fosforilazione consenta l’identificazione di firme fosfoproteiche specifiche della malattia come potenziali biomarcatori, la bassa abbondanza e la natura dinamica delle fosfoproteine pongono grandi sfide nello sviluppo delle fosfoproteine come biomarcatori^11,12. In particolare, le fosfoproteine poco abbondanti incapsulate all’interno delle vescicole extracellulari sono protette dalla digestione enzimatica esterna nell’ambiente extracellulare⁸. Di conseguenza, le vescicole extracellulari e le fosfoproteine derivate da EV offrono una fonte ideale per la scoperta di biomarcatori nella diagnosi precoce del cancro e di altre malattie.

Sebbene l’analisi della fosforilazione delle proteine nelle vescicole extracellulari offra una risorsa preziosa per comprendere la segnalazione del cancro e la diagnosi precoce della malattia, la mancanza di metodi efficienti di isolamento delle vescicole extracellulari rappresenta un ostacolo importante. L’isolamento delle vescicole extracellulari è comunemente ottenuto attraverso l’ultracentrifugazione differenziale (DUC)¹³. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo e non è adatto per le implicazioni cliniche a causa della bassa produttività e della scarsa riproducibilità^13,14. Gli approcci alternativi di isolamento delle EV, come la precipitazione indotta da polimeri¹⁵, sono limitati dalla bassa specificità dovuta alla co-precipitazione delle proteine non-EV. Gli approcci basati sull’affinità, tra cui la cattura dell’affinità basata sugli anticorpi¹⁶ e la filtrazione dell’affinità¹⁷, offrono una maggiore specificità, ma sono limitati a un tasso di recupero relativamente basso a causa del volume ridotto.

Per affrontare i problemi nell’esplorazione della dinamica delle fosfoproteine nelle vescicole extracellulari, il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica di recupero e purificazione totale delle vescicole extracellulari (EVtrap) basata sull’affinità chimica per catturare le vescicole extracellulari su microsfere magnetiche funzionalizzate¹⁸. Risultati precedenti hanno dimostrato che questo metodo di isolamento delle vescicole extracellulari basato su microsfere magnetiche è altamente efficace nell’isolare le vescicole extracellulari da un’ampia gamma di campioni di biofluidi ed è in grado di ottenere una resa di vescicole extracellulari molto più elevata, riducendo al minimo la contaminazione rispetto al DUC e ad altri metodi di isolamento esistenti^18,19. Abbiamo utilizzato con successo EVtrap e un metodo di arricchimento di fospopeptidi a base di titanio sviluppato dal nostro gruppo²⁰ per profilare il fosfoproteoma di vescicole extracellulari derivate da diversi biofluidi e per rilevare potenziali biomarcatori fosfoproteici per varie malattie 19,21,22.

Qui presentiamo un protocollo basato su EVtrap per l’isolamento delle vescicole extracellulari circolanti. Il protocollo si concentra sulle vescicole extracellulari urinarie. Dimostriamo anche la caratterizzazione di vescicole extracellulari isolate utilizzando il western blotting. Descriviamo quindi in dettaglio la preparazione del campione e l’acquisizione della spettrometria di massa (MS) per le analisi di proteomica e fosfoproteomica. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente e riproducibile per la profilazione del proteoma e del fosfoproteoma delle vescicole extracellulari urinarie, che faciliterà ulteriori studi sulle vescicole extracellulari e sulle loro applicazioni cliniche²³.

Protocol

Tutti i campioni di urina sono stati raccolti da individui sani dopo il consenso informato. Gli esperimenti erano conformi a tutti gli standard etici che coinvolgono campioni umani e conformi alle linee guida del programma di protezione della ricerca umana della Purdue University. 1. Raccolta dei campioni Centrifugare 12 mL di campione di urina in una provetta da centrifuga conica da 15 mL per 10 minuti a 2.500 x g, 4 °C per rimuovere i detriti cellulari e …

Representative Results

Questo protocollo dimostra un flusso di lavoro completo, dall’isolamento delle vescicole extracellulari alle analisi di proteomica e fosfoproteomica a valle (Figura 1). I campioni di urina triplicati sono stati sottoposti a isolamento EV. Le vescicole extracellulari isolate sono state caratterizzate mediante western blotting e successivamente processate per la preparazione del campione di proteomica basata sulla spettrometria di massa, compresa l’estrazione delle proteine, la digestione enzi…

Discussion

L’isolamento efficace delle vescicole extracellulari è un prerequisito essenziale per rilevare proteine e fosfoproteine a bassa abbondanza nelle vescicole extracellulari. Nonostante lo sviluppo di numerosi metodi per soddisfare questa esigenza, la maggior parte soffre ancora di limitazioni come lo scarso recupero o la bassa riproducibilità, che ne impediscono l’utilizzo in studi su larga scala e contesti clinici di routine. Il DUC è generalmente considerato il metodo più comune per l’isolamento delle vescicole extrac…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007