Aislamiento Basado en la Afinidad Química de Vesículas Extracelulares a partir de Biofluidos para Análisis de Proteómica y Fosfoproteómica

Resumen

El presente protocolo proporciona descripciones detalladas para el aislamiento eficiente de vesículas extracelulares urinarias utilizando perlas magnéticas funcionalizadas. Además, abarca análisis posteriores, como Western blot, proteómica y fosfoproteómica.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) de los biofluidos han ganado recientemente una atención significativa en el campo de la biopsia líquida. Liberados por casi todos los tipos de células, proporcionan una instantánea en tiempo real de las células huésped y contienen una gran cantidad de información molecular, incluidas las proteínas, en particular aquellas con modificaciones postraduccionales (PTM) como la fosforilación, como el principal actor de las funciones celulares y la aparición y progresión de enfermedades. Sin embargo, el aislamiento de los vehículos eléctricos a partir de biofluidos sigue siendo un reto debido a los bajos rendimientos y las impurezas de los métodos actuales de aislamiento de los vehículos eléctricos, lo que dificulta el análisis posterior de la carga de los vehículos eléctricos, como las fosfoproteínas de los mismos. Aquí, describimos un método rápido y efectivo de aislamiento de EV basado en perlas magnéticas funcionalizadas para el aislamiento de EV de biofluidos como la orina humana y el análisis de proteómica y fosfoproteómica aguas abajo después del aislamiento de EV. El protocolo permitió un alto rendimiento de recuperación de las VE urinarias y perfiles sensibles del proteoma y el fosfoproteoma de las VE. Además, aquí también se abordan la versatilidad de este protocolo y las consideraciones técnicas pertinentes.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encapsuladas en membranas secretadas por todo tipo de células y están presentes en biofluidos como sangre, orina, saliva, etc.1,2,3,4. Los VE transportan una carga de diversas moléculas bioactivas que reflejan el estado fisiológico y patológico de sus células huésped y, por lo tanto, funcionan como factores cruciales en la progresión de la enfermedad ^4,5,6. Además, amplios estudios han establecido....

Protocolo

Todas las muestras de orina se recogieron de individuos sanos después del consentimiento informado. Los experimentos cumplieron con todos los estándares éticos que involucran muestras humanas y se ajustan a las pautas del Programa de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de Purdue.

1. Recogida de muestras

1. Centrifugar 12 mL de muestra de orina en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL durante 10 min a 2.500 x g, 4 °C para eliminar restos celulares y cuerpos apoptóticos grandes.
2. Transfiera 10 ml del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y proceda con el aislamiento EV.
   NOTA: El....

Resultados

Este protocolo demuestra un flujo de trabajo completo desde el aislamiento de los VE hasta los análisis de proteómica y fosfoproteómica posteriores (Figura 1). Las muestras de orina por triplicado se sometieron a aislamiento EV. Los VE aislados se caracterizaron mediante Western blot y posteriormente se procesaron para la preparación de muestras proteómicas basadas en espectrometría de masas, incluida la extracción de proteínas, la digestión enzimática y la limpieza de péptidos. Para el anál.......

Discusión

El aislamiento eficaz de las VE es un requisito previo esencial para detectar proteínas y fosfoproteínas de baja abundancia en las VE. A pesar del desarrollo de numerosos métodos para satisfacer esta necesidad, la mayoría todavía sufren de limitaciones como una recuperación deficiente o una baja reproducibilidad, que impiden su utilización en estudios a gran escala y entornos clínicos rutinarios. El DUC se considera generalmente como el método más común para el aislamiento de los vehículos eléctricos, y los pasos de lava.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	ciencias de la vida	M-1700C-LB
Bastidor separador magnético de tubo de 1,5 mL	Sergi Lab Supplies	1005
Tubo de centrífuga cónico de 15 mL	Corning
Bastidor separador magnético de tubo de 15 ml	Sergi Lab Supplies	1002
IgG anti-conejo, tecnología de señalización de células de anticuerpos ligados a HRP		7074P2
Agitador incubado de sobremesa	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Bloque de mezcla de termoceldas MB-101
CD9 (D3H4P) Tecnología	de señalización de células	13403S
Cloroacetamida	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Se utiliza para la alquilación de grupos sulfuro reducidos. Preparar 400 mM en agua como solución madre.
Acetato de etilo	Fisher Scientific	E145-4	Precipitados detergentes
Evosep One	Evosep		Sistema de cromatografía líquida
Evotips Evosep		EV2013	Carga de muestras para el sistema Evosep One
EVtrap	Tymora Analítico		Perlas magnéticas funcionalizadas, tampón de carga y tampón de lavado
Immobilon-FL Membrana de PVDF	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Membrana de transferencia
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen NP0322BOX		Invitrogen NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Gel de Proteínas, 12 pocillos
NuPAGE LDS Tampón de muestra (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Columna de separación
Cóctel de inhibidores de fosfatasa 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Inhibidor de la fosfatasa.
Cóctel de inhibidores de fosfatasa 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Inhibidor de la fosfatasa.
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA ThermoFisher		23225
Pierce ECL Sustrato de Western Blotting	ThermoFisher	32106	HRP substrate
Kit de enriquecimiento de fosfopéptidos PolyMAC	Tymora Analytical		Captura de afinidad de iones metálicos a base de polímeros (PolyMAC) para el enriquecimiento de fosfopéptidos
Desoxicolato de sodio	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergente para tampón de lisis. Preparar 120 mM en agua como solución madre.
Laurooil sarcosinato de sodio	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergente para tampón de lisis. Preparar 120 mM en agua como solución madre.
timsTOF HT	Bruker		Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de movilidad iónica atrapada
TopTip C-18 (10-200 μ L) consejos	Glygen	TT2C18.96	Método de desalinización
Trietilamina	Sigma -Aldrich	471283-100ML	para elución EV.
Tampón bicabonato de trietilamonio	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Ácido trifluoroacético	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Clorhidrato de tris-(2-carboxietil)fosfina	Sigma -Aldrich	C4706	Se utiliza para la reducción de enlaces disulfuro. Preparar 200 mM en agua como solución madre. Alicucuota la solución madre en pequeño volumen y almacenarla en at-20 & grados; C (evite múltiples ciclos de congelación y descongelación).
Tripsina/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007

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