Kjemisk affinitetsbasert isolering av ekstracellulære vesikler fra biofluider for proteomikk og fosfoproteomikkanalyse

Summary

Den nåværende protokollen gir detaljerte beskrivelser for effektiv isolering av ekstracellulære urinvesikler ved bruk av funksjonaliserte magnetiske perler. Videre omfatter det etterfølgende analyser, inkludert vestlig blotting, proteomikk og fosfoproteomikk.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV) fra biofluider har nylig fått betydelig oppmerksomhet innen flytende biopsi. Utgitt av nesten alle typer celler, gir de et sanntids øyeblikksbilde av vertsceller og inneholder et vell av molekylær informasjon, inkludert proteiner, spesielt de med posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) som fosforylering, som hovedspiller av cellulære funksjoner og sykdomsutbrudd og progresjon. Imidlertid er isoleringen av elbiler fra biofluider fortsatt utfordrende på grunn av lave utbytter og urenheter fra dagens EV-isolasjonsmetoder, noe som gjør nedstrømsanalysen av EV-last, som EV-fosfoproteiner, vanskelig. Her beskriver vi en rask og effektiv EV-isolasjonsmetode basert på funksjonaliserte magnetiske perler for EV-isolasjon fra biofluider som human urin og nedstrøms proteomikk og fosfoproteomikkanalyse etter EV-isolasjon. Protokollen muliggjorde et høyt utvinningsutbytte av urin-EV og følsomme profiler av EV-proteom og fosfoproteom. Videre er allsidigheten til denne protokollen og relevante tekniske hensyn også adressert her.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV) er membraninnkapslede nanopartikler utskilt av alle typer celler og er tilstede i biofluider som blod, urin, spytt, etc.1,2,3,4. Elbiler bærer en last med forskjellige bioaktive molekyler som gjenspeiler den fysiologiske og patologiske tilstanden til vertscellene, og fungerer derfor som avgjørende faktorer i sykdomsprogresjon ^4,5,6. Videre har omfattende studier fastslått at EV-baserte sykdomsmarkører kan identifiseres før symptomene begynner eller den fysiologiske påvisningen av svulster ^5,6,7.

Fosforylering fungerer som en nøkkelmekanisme i cellulær signalering og regulering. Derfor gir fosfoproteiner en verdifull kilde for biomarkøroppdagelse da avvikende fosforyleringshendelser er assosiert med dysregulerte cellulære signalveier og metastatisk sykdomsutvikling som kreft ^8,9,10. Selv om profilering av fosforyleringsdynamikk gjør det mulig å identifisere sykdomsspesifikke fosfoproteinsignaturer som potensielle biomarkører, utgjør fosfoproteiners lave overflod og dynamiske natur store utfordringer i utviklingen av fosfoproteiner som biomarkører^11,12. Spesielt er de lave fosfoproteinene innkapslet i EV beskyttet mot ekstern enzymatisk fordøyelse i det ekstracellulære miljøet⁸. Følgelig tilbyr EV og EV-avledede fosfoproteiner en ideell kilde for biomarkøroppdagelse i tidlig påvisning av kreft og andre sykdommer.

Selv om analyse av proteinfosforylering i elbiler gir en verdifull ressurs for å forstå kreftsignalering og sykdomsdiagnose på et tidlig stadium, utgjør mangelen på effektive EV-isolasjonsmetoder en stor barriere. EV-isolasjon oppnås vanligvis gjennom differensiell ultrasentrifugering (DUC)¹³. Denne metoden er imidlertid tidkrevende og er ikke egnet for kliniske implikasjoner på grunn av lav gjennomstrømning og dårlig reproduserbarhet^13,14. Alternative EV-isolasjonsmetoder, som polymerindusert utfelling¹⁵, er begrenset av lav spesifisitet på grunn av samutfelling av ikke-EV-proteiner. Affinitetsbaserte tilnærminger, inkludert antistoffbasert affinitetsfangst¹⁶ og affinitetsfiltrering¹⁷, gir forbedret spesifisitet, men er begrenset til en relativt lav gjenvinningsgrad på grunn av lite volum.

For å løse problemene med å utforske fosfoproteindynamikk i EV, har vår gruppe utviklet ekstracellulære vesikler total utvinning og rensing (EVtrap) teknikk basert på kjemisk affinitet for å fange EV på funksjonaliserte magnetiske perler¹⁸. Tidligere resultater har vist at denne magnetiske perlebaserte EV-isolasjonsmetoden er svært effektiv for å isolere elbiler fra et bredt spekter av biofluidprøver og er i stand til å oppnå mye høyere EV-utbytte samtidig som forurensning minimeres sammenlignet med DUC og andre eksisterende isolasjonsmetoder^18,19. Vi har med hell benyttet EVtrap og en titanbasert fosfopenptidberikelsesmetode utviklet av vår gruppe²⁰ for å profilere fosfoproteomet til EV avledet fra forskjellige biofluider og for å oppdage potensielle fosfoproteinbiomarkører for ulike sykdommer 19,21,22.

Her presenterer vi en protokoll basert på EVtrap for isolering av sirkulerende elbiler. Protokollen fokuserer på urin-elbilene. Vi demonstrerer også karakteriseringen av isolerte elbiler ved hjelp av vestlig blotting. Deretter redegjør vi for prøvepreparering og massespektrometri (MS) for både proteomikk- og fosfoprotomikkanalyser. Denne protokollen gir en effektiv og reproduserbar arbeidsflyt for profilering av EV-proteom og fosfoproteom i urinen, noe som vil legge til rette for videre studier av EV og deres kliniske applikasjoner²³.

Protocol

Alle urinprøver ble tatt fra friske personer etter informert samtykke. Forsøkene var i samsvar med alle etiske standarder som involverte menneskelige prøver og i samsvar med retningslinjene fra Purdue University Human Research Protection Program. 1. Prøveinnsamling Sentrifuge 12 ml urinprøve i et 15 ml konisk sentrifugerør i 10 minutter ved 2,500 x g, 4 °C for å fjerne cellerester og store apoptotiske legemer. Overfør 10 ml av supernatante…

Representative Results

Denne protokollen demonstrerer en omfattende arbeidsflyt fra isolering av elbiler til nedstrøms proteomikk og fosfoproteomikkanalyser (figur 1). De triplikate urinprøvene ble utsatt for EV-isolasjon. De isolerte elbilene ble karakterisert ved vestlig blotting og deretter behandlet for massespektrometribasert proteomikkprøvepreparering, inkludert proteinekstraksjon, enzymatisk fordøyelse og peptidopprydding. For fosfoproteomikkanalyse ble fosfoptidene ytterligere anriket basert på metall…

Discussion

Effektiv EV-isolasjon er en viktig forutsetning for å oppdage proteiner og fosfoproteiner med lite rikelig i elbiler. Til tross for utviklingen av mange metoder for å oppfylle dette behovet, lider flertallet fortsatt av begrensninger som dårlig utvinning eller lav reproduserbarhet, noe som hindrer bruken av dem i store studier og rutinemessige kliniske omgivelser. DUC anses generelt som den vanligste metoden for EV-isolasjon, og de ekstra vasketrinnene brukes normalt for å øke renheten til mål-EV^2…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007