İnmenin Geçici Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli
Summary
Bu protokol, orta serebral arterin intraluminal oklüzyonu yoluyla farelerde geçici fokal serebral iskemi modelini açıklar. Ek olarak, manyetik rezonans görüntüleme ve davranış testleri kullanılarak sonuç değerlendirme örnekleri gösterilmiştir.
Abstract
İnme, küresel olarak önemli bir ölüm veya kronik sakatlık nedeni olarak durmaktadır. Bununla birlikte, mevcut optimal tedaviler iskemik inmenin akut fazında reperfüzyon tedavileri ile sınırlıdır. İnme fizyopatolojisi hakkında bilgi edinmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımlar geliştirmek için, in vivo kemirgen inme modelleri temel bir rol oynamaktadır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların mevcudiyeti, farelerin deneysel inme modelleri olarak kullanılmasını özellikle teşvik etmiştir.
İnme hastalarında orta serebral arter (MCA) tıkanması sık görülen bir durumdur. Sonuç olarak, en yaygın deneysel model, kraniektomi gerektirmeyen minimal invaziv bir teknik olan MCA’nın intraluminal oklüzyonunu içerir. Bu prosedür, dış karotis arterden (ECA) bir monofilament yerleştirmeyi ve MCA’nın dallanma noktasına ulaşana kadar iç karotis arter (ICA) boyunca ilerletmeyi içerir. 45 dakikalık bir arteriyel tıkanıklıktan sonra, reperfüzyona izin vermek için monofilament çıkarılır. İşlem boyunca, oklüzyon sırasında azalmayı ve ardından reperfüzyon üzerine iyileşmeyi doğrulamak için serebral kan akışı izlenir. Nörolojik ve doku sonuçları, davranışsal testler ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) çalışmaları kullanılarak değerlendirilir.
Introduction
Dünya Sağlık Örgütü’ne göre inme, dünya çapında yılda yaklaşık 15 milyon insanı etkileyen yıkıcı bir hastalıktır. Hastaların yaklaşık üçte biri bu duruma yenik düşerken, üçte biri kalıcı sakatlık yaşar. İnme, nöral ve periferik immün hücreler, damar sistemi ve sistemik yanıtlar gibi çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık bir patolojidir1. Sistem düzeyinde inme ile tetiklenen karmaşık reaksiyon ağı, şu anda in vitro modeller kullanılarak çoğaltılamamaktadır. Bu nedenle, deneysel hayvan modelleri, hastalığın mekanizmalarını araştırmak ve yeni tedaviler geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Şu anda, erken doku reperfüzyonu, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ile tromboliz veya endovasküler trombektomi1 yoluyla onaylanmış tek müdahaledir.
İnme hastalarında orta serebral arter (MCA) tıkanıklıkları sık görülür. Sonuç olarak, geçici MCA oklüzyonunun (tMCAo) kemirgen modelleri başlangıçta sıçanlardageliştirilmiştir 2,3,4. Günümüzde, genetiği değiştirilmiş fareler, deneysel inme modellerinde en yaygın kullanılan hayvanlardır. Bu çalışmada, farelerde minimal invaziv bir intraluminal tMCAo modeli tanımlanmıştır. Yaklaşım, kraniektomi yapılmadan boyun seviyesindeki karotis arter yoluyla gerçekleştirilir.
Oklüzyon süresinin süresi, iskemik lezyonun yaygınlığını belirleyen kritik bir faktördür. 10 dakikalık kısa tıkanıklıklar bile belirgin bir enfarktüs olmadan seçici nöronal ölüme neden olabilirken, tipik olarak 30 ila 60 dakika süren daha uzun tıkanıklıklar bir dereceye kadar serebral enfarktüse neden olur. MCA’nın korteksi besleyen ve kollateralleri olan proksimal ve distal dallarının aksine, striatuma kan sağlayan lentikülo-striatal arterlerde teminat yoktur5. Sonuç olarak, striatumdaki kan akışında tMCAo’dan sonra kortekse göre daha fazla azalma olur. Bu nedenle, 30 dakika veya daha kısa oklüzyonlar genellikle striatumu etkiler, ancak korteksi etkilemezken, 45 dakikadan itibaren daha uzun oklüzyonlar genellikle striatum ve dorsolateral korteks dahil olmak üzere tüm MCA bölgesinde iskemik bir lezyon oluşturur.
Farelerin refahını sağlamak için işlemden önce analjezik uyguluyoruz ve ameliyat sırasında anestezi kullanıyoruz. Bununla birlikte, anestezi potansiyel olarak farenin fizyolojisinde yapay değişiklikler getirebilir ve bazı sonuç ölçütlerini etkileyebilir6. Cerrahi müdahale, deneyimli personel tarafından yapıldığında, MCAo’yu indüklemek için genellikle yaklaşık 15 dakika sürer. Daha sonra, anestezi altındaki toplam süre oklüzyon süresine bağlıdır. Anestezinin en aza indirilmesinin çok önemli olduğu deneyler için, prosedürdeki alternatif bir adım, oklüzyon döneminde anestezinin kesilmesini ve sadece MCA’yı tıkayan filamentin yerleştirilmesi ve geri çekilmesi için cerrahi adımlarla sınırlandırılmasını içerir. Bu yaklaşım anestezi süresini azaltır ve deneysel model 7,8 üzerindeki potansiyel artefaktsal etkilerini en aza indirir. Bu nedenle, geçici fokal iskemiyi indükleme yöntemi, MCA’nın intraluminal oklüzyonu ile iki varyantla sunulur: tüm oklüzyon süresi boyunca fare uyuşturularak veya bu süre boyunca fare uyanıkken. Her iki durumda da, iskemik fareler üzerinde gerçekleştirilen müdahaleye paralel olarak sahte bir ameliyat yapılmalıdır. Ek olarak, sonuç değerlendirmesine ilişkin veriler, reperfüzyondan sonra çeşitli zaman noktalarında davranış testleri ve MRG ile ölçüldüğü şekilde sağlanır. Son olarak, deneysel prosedürü uygularken göz önünde bulundurulması gereken ana faktörler tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İntraluminal tMCAo prosedürü, temel araştırmalarda reperfüzyonlu fokal beyin iskemisinin en sık kullanılan modelidir. Şu anda, genetiği değiştirilmiş suşların mevcudiyeti nedeniyle fareler tercih edilen hayvan modelidir. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş farelerin ve genetik geçmişlerinin beyin vaskülarizasyonunu etkileyebileceğini kabul etmek önemlidir. Farklı arter bölgeleri arasında kollateral dolaşım ve anastomozların varlığı, deneysel prosedürlerin sonuçlarını önemli öl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 ve “Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) tarafından finanse edilen PID2020-113202RB-I00 hibesi ile desteklenmiştir. Avrupa’yı yaratmanın bir yolu”. NCC ve MAR, MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 tarafından finanse edilen doktora öncesi burslara (sırasıyla PRE2021-099481 ve PRE2018-085737) sahipti. Teknik destekleri için Francisca Ruiz-Jaén ve Leonardo Márquez-Kisinousky’ye teşekkür ederiz. Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer’in (IDIBAPS) MRI görüntüleme tesisinin desteğini kabul ediyoruz. Generalitat de Catalunya’nın Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) Programı IDIBAPS’ı desteklemektedir.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
