Her beskriver vi en to-trins cellefordøjelsesprotokol til fremstilling af en enkeltcellesuspension af musehalspulsårer.
Carotidarterier er store blodkar i nakken, der leverer blod og ilt til hjernen, men carotisstenose opstår, når halspulsårerne er tilstoppet af plak. Afsløring af den cellulære sammensætning af halspulsåren på enkeltcelleniveau er afgørende for behandling af carotis aterosklerose. Der er imidlertid ingen brugsklar protokol til fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra halspulsårer. For at opnå en passende protokol til dissociation af normale halspulsårer på enkeltcelleniveau med mindre skade på celler, designede vi en to-trins fordøjelsesmetode ved at integrere fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev der påvist en median på ~ 2500 transkripter pr. Celle i hver halspulsårecelle. Især var en række celletyper af den normale halspulsåre, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC’er), fibroblaster, endotelceller (EC’er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC’er), samtidig detekterbare. Denne protokol kan anvendes til fremstilling af en enkeltcellesuspension af blodkar fra andre væv med passende modifikationer.
Åreforkalkning er en kronisk inflammatorisk sygdom forbundet med risikofaktorer som forhøjet blodtryk, hyperlipidæmi og hæmodynamik1. Carotidarteriebifurkationer er tilbøjelige til hæmodynamiske ændringer og fører til dannelse af carotisplak. Den kliniske præsentation af carotis aterosklerose kan være akut såsom slagtilfælde og forbigående cerebral iskæmi eller kronisk såsom tilbagevendende forbigående cerebral iskæmi og vaskulær demens2. Mekanisk er carotisplaque resultatet af interaktionen mellem forskellige karvægceller og forskellige blodlegemer under patologiske tilstande. Derfor er det særligt vigtigt at afsløre encelleatlaset af carotiskar under fysiologiske og patologiske tilstande for at forebygge og behandle udvikling af carotisplaque.
Enkeltcelle RNA-sekventering er en af de mest kraftfulde teknologier inden for biologisk forskning på grund af dens ultrahøje opløsning og påvisning af celleheterogenitet fra den samme celletype af organismer 3,4. Forskere har brugt enkeltcelle RNA-sekventering til at udføre forskning på mange områder, såsom hjerte-kar-sygdomme5 og kræft6. Imidlertid er hurtig og præcis adskillelse af væv i enkeltceller stadig en af de største udfordringer. Enzymatisk dissociation er en almindeligt anvendt metode, der dominerende omfatter collagenase, papain, trypsin, DNase og hyaluronidase. Specifikt er collagenaser de vigtigste enzymarter til enkeltcellefordøjelse, hovedsageligt hydrolyserende kollagenkomponenter i bindevæv. Forskellige kollagenasetyper kan anvendes til dissociation af forskellige væv, såsom brystkirtlen7, glomerulus8, iridocorneal vinkel9, knæleddet 10, aorta11 og lunge12. På grund af de unikke fysiologiske egenskaber ved forskellige væv kan dissociation ved hjælp af samme metode forårsage mange problemer med at erhverve enkeltceller, såsom lav cellelevedygtighed, lavt celleantal og store celleaffald. Derfor er opfindelsen af fordøjelsesmetoder til forskellige væv afgørende for fremstilling af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet.
Denne protokol sigter mod at udvikle en to-trins cellefordøjelsesmetode til fremstilling af en enkeltcellesuspension af halspulsåren hos vildtypemus. I henhold til halspulsårens egenskaber kombinerede vi collagenase/DNase med trypsin for at opnå en højkvalitets enkeltcellesuspension af musens halspulsåre, fordi collagenase kan hydrolysere kollagen af halsvævene, som blev yderligere fordøjet af trypsin til en enkeltcellesuspension. Acridin orange / propidiumiodid (AO / PI) dobbeltfluorescenstælling blev brugt til at detektere cellelevedygtighed og koncentration, og det blev fundet, at enkeltcellesuspensionen opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med levedygtigheden af celler over 85% og en høj cellekoncentration. Efter enkeltcelle databehandling blev fire celletyper, herunder vaskulære glatte muskelceller (VSMC’er), fibroblaster, endotelceller (EC’er) og makrofager og dendritiske celler (Mφ / DC’er), identificeret i normale musehalspulsårer efter fordøjelsen. Fordelene ved denne protokol er, at: 1) flere celletyper i halspulsåren kan identificeres, 2) cellelevedygtighed er velbevaret, og 3) det kan let gentages uden specielt udstyr. Denne protokol er velegnet til forskere, der er interesserede i at studere enkeltcelle multiomics af musens halspulsårer. Denne protokol kan også være nyttig i dissociation af andre blodkar med passende ændringer.
Her giver vi en detaljeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra halspulsåren hos vildtypemus, hvor en to-trins fordøjelsesmetode, der integrerer fordøjelsesprocessen af collagenase/DNase og trypsin, blev konstrueret. Efter kvalitetskontrollen af enkeltcellesuspensionen fandt vi, at den opfyldte kravene til enkeltcellesekventering med cellernes levedygtighed over 85% og en høj cellekoncentration. Desuden blev en række celletyper i halspulsåren, herunder VSMC’er, fibroblaster, EC’er…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation of China (82070450 til C.T. og 82170466 til L.Z.) og stipendiet fra China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 til F.L.).
0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |