Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing
Summary
Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.
Abstract
Halsslagaders zijn belangrijke bloedvaten in de nek die bloed en zuurstof naar de hersenen voeren, maar halsslagaderstenose treedt op wanneer halsslagaders verstopt zijn door plaque. Het onthullen van de cellulaire samenstelling van de halsslagader op het niveau van één cel is essentieel voor de behandeling van atherosclerose van de halsslagader. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor de bereiding van eencellige suspensies uit halsslagaders. Om een geschikt protocol te verkrijgen voor de dissociatie van normale halsslagaders op het niveau van één cel met minder schade aan cellen, ontwierpen we een verteringsmethode in twee stappen door het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine te integreren. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van gegevens met één cel werd een mediaan van ~2500 transcripten per cel gedetecteerd in elke cel van de halsslagader. Met name een verscheidenheid aan celtypen van de normale halsslagader, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s), fibroblasten, endotheelcellen (EC’s) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC’s), waren gelijktijdig detecteerbaar. Dit protocol kan worden toegepast om een eencellige suspensie van bloedvaten uit andere weefsels te bereiden met de nodige aanpassingen.
Introduction
Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte die gepaard gaat met risicofactoren zoals hoge bloeddruk, hyperlipidemie en hemodynamica. Bifurcaties van de halsslagader zijn vatbaar voor hemodynamische veranderingen en leiden tot de vorming van plaque in de halsslagader. De klinische presentatie van atherosclerose van de halsslagader kan acuut zijn, zoals beroerte en voorbijgaande cerebrale ischemie, of chronisch, zoals recidiverende voorbijgaande cerebrale ischemie en vasculaire dementie2. Mechanisch gezien is halsslagaderplaque het resultaat van de interactie tussen verschillende vaatwandcellen en verschillende bloedcellen onder pathologische omstandigheden. Daarom is het onthullen van de eencellige atlas van halsslagaders onder fysiologische en pathologische omstandigheden bijzonder belangrijk voor het voorkomen en behandelen van de ontwikkeling van halsslagaderplaques.
Single-cell RNA-sequencing is een van de krachtigste technologieën van biologisch onderzoek vanwege de ultrahoge resolutie en detectie van celheterogeniteit van hetzelfde celtype organismen 3,4. Onderzoekers hebben single-cell RNA-sequencing gebruikt om onderzoek te doen op vele gebieden, zoals hart- en vaatziekten5 en kanker6. Het snel en nauwkeurig scheiden van weefsels in afzonderlijke cellen is echter nog steeds een van de grootste uitdagingen. Enzymatische dissociatie is een veelgebruikte methode die voornamelijk collagenase, papaïne, trypsine, DNase en hyaluronidase omvat. In het bijzonder zijn collagenasen de belangrijkste enzymsoorten voor de vertering van eencellige cellen, voornamelijk hydrolyserende collageencomponenten in bindweefsels. Verschillende soorten collagenase zijn toepasbaar voor de dissociatie van verschillende weefsels, zoals de borstklier7, glomerulus8, iridocorneale hoek9, kniegewricht 10, aorta11 en long12. Vanwege de unieke fysiologische eigenschappen van verschillende weefsels, kan dissociatie met dezelfde methode veel problemen veroorzaken bij het verkrijgen van afzonderlijke cellen, zoals een lage levensvatbaarheid van cellen, een laag aantal cellen en groot celafval. Daarom is de uitvinding van verteringsmethoden voor verschillende weefsels essentieel voor het bereiden van hoogwaardige eencellige suspensies.
Dit protocol heeft tot doel een tweestaps celverteringsmethode te ontwikkelen om een eencellige suspensie van de halsslagader van wildtype muizen te bereiden. Volgens de kenmerken van de halsslagader hebben we collagenase/DNase gecombineerd met trypsine om een hoogwaardige eencellige suspensie van de halsslagader van de muis te verkrijgen, omdat collagenase collageen van de halsslagaderweefsels kan hydrolyseren, dat verder werd verteerd door trypsine tot een eencellige suspensie. Acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI) dubbele fluorescentietelling werd gebruikt om de levensvatbaarheid en concentratie van cellen te detecteren, en er werd vastgesteld dat de eencellige suspensie voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Na verwerking van eencellige gegevens werden vier celtypen, waaronder vasculaire gladde spiercellen (VSMC’s), fibroblasten, endotheelcellen (EC’s) en macrofagen en dendritische cellen (Mφ/DC’s), geïdentificeerd in normale halsslagaders van muizen na vertering. De voordelen van dit protocol zijn dat: 1) meerdere celtypen in de halsslagader kunnen worden geïdentificeerd, 2) de levensvatbaarheid van de cellen goed behouden blijft en 3) het gemakkelijk kan worden herhaald zonder speciale apparatuur. Dit protocol is geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van eencellige multiomics van de halsslagaders van muizen. Dit protocol kan ook nuttig zijn bij de dissociatie van andere bloedvaten met de juiste aanpassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de halsslagader van wildtype muizen, waarin een tweestaps verteringsmethode werd geconstrueerd die het verteringsproces van collagenase/DNase en trypsine integreert. Na de kwaliteitscontrole van de eencellige suspensie stelden we vast dat deze voldeed aan de vereisten voor sequencing van één cel, met een levensvatbaarheid van cellen van meer dan 85% en een hoge celconcentratie. Bovendien werden verschillende celtyp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (82070450 aan C.T. en 82170466 aan L.Z.) en de fellowship van China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 aan F.L.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -. F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
