הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול עיכול תאים דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים.
Abstract
עורקי התרדמה הם כלי דם מרכזיים בצוואר המספקים דם וחמצן למוח, אך היצרות התרדמה מתרחשת כאשר עורקי התרדמה נסתמים על ידי פלאק. חשיפת ההרכב התאי של עורק התרדמה ברמת התא הבודד חיונית לטיפול בטרשת עורקים של התרדמה. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש להכנת מתלים חד-תאיים מעורקי התרדמה. כדי לקבל פרוטוקול מתאים לדיסוציאציה של עורקי התרדמה הרגילים ברמת התא הבודד עם פחות נזק לתאים, תכננו שיטת עיכול דו-שלבית על ידי שילוב תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, חציון של ~2500 תעתיקים לכל תא זוהו בכל תא עורק התרדמה. יש לציין כי מגוון סוגי תאים של עורק התרדמה התקין, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), היו ניתנים לגילוי בו זמנית. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם להכנת תרחיף חד תאי של כלי דם מרקמות אחרות עם שינויים מתאימים.
Introduction
טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית הקשורה לגורמי סיכון כגון לחץ דם גבוה, היפרליפידמיה, והמודינמיקה1. התפצלויות בעורק התרדמה מועדות לשינויים המודינמיים ומובילות להיווצרות רובד התרדמה. ההצגה הקלינית של טרשת עורקים קרוטיד יכולה להיות חריפה כגון שבץ מוחי ואיסכמיה מוחית חולפת, או כרונית כגון איסכמיה מוחית חולפת חוזרת ודמנציה וסקולרית2. מבחינה מכנית, רובד התרדמה הוא תוצאה של אינטראקציה בין תאי דופן כלי דם שונים ותאי דם שונים בתנאים פתולוגיים. לכן, חשיפת האטלס החד-תאי של כלי התרדמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים חשובה במיוחד למניעה וטיפול בהתפתחות פלאק התרדמה.
ריצוף RNA חד-תאי הוא אחת הטכנולוגיות החזקות ביותר של המחקר הביולוגי בגלל הרזולוציה הגבוהה במיוחד שלו וזיהוי הטרוגניות התא מאותו סוג תא של אורגניזמים 3,4. חוקרים השתמשו בריצוף RNA חד-תאי כדי לערוך מחקרים בתחומים רבים, כגון מחלות לב וכלי דם5 וסרטן6. עם זאת, הפרדה מהירה ומדויקת של רקמות לתאים בודדים היא עדיין אחד האתגרים העיקריים. דיסוציאציה אנזימטית היא שיטה נפוצה הכוללת בעיקר קולגנאז, פפאין, טריפסין, DNase והיאלורונידאז. בפרט, collagenases הם מיני האנזימים העיקריים לעיכול של תא יחיד, בעיקר הידרוליזה של רכיבי קולגן ברקמות חיבור. סוגים שונים של collagenase ישימים לדיסוציאציה של רקמות שונות, כגון בלוטת החלב7, גלומרולוס8, זווית אירידוקרנית9, מפרק הברך 10, אבי העורקים11 וריאה12. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של רקמות שונות, דיסוציאציה באותה שיטה עלולה לגרום לבעיות רבות ברכישת תאים בודדים, כגון כדאיות נמוכה של תאים, מספר תאים נמוך ופסולת תאים גדולים. לכן, המצאת שיטות העיכול לרקמות שונות חיונית להכנת תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה.
פרוטוקול זה נועד לפתח שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורק התרדמה של עכברי בר. בהתאם למאפיינים של עורק התרדמה, שילבנו collagenase/DNase עם טריפסין כדי לקבל תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של עורק התרדמה של עכבר, מכיוון ש-collagenase יכול לבצע הידרוליזה של קולגן ברקמות התרדמה, אשר התעכל עוד יותר על-ידי טריפסין לתרחיף חד-תאי. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, ארבעה סוגי תאים, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), זוהו בעורקי התרדמה הרגילים של עכברים לאחר העיכול. היתרונות של פרוטוקול זה הם: 1) ניתן לזהות סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, 2) כדאיות התא נשמרת היטב, 3) ניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד. פרוטוקול זה מתאים לחוקרים המעוניינים לחקור מולטיומיקה חד-תאית של עורקי התרדמה בעכבר. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מועיל בדיסוציאציה של כלי דם אחרים עם שינויים מתאימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תרחיף חד-תאי איכותי מעורק התרדמה של עכברי בר, שבו נבנתה שיטת עיכול דו-שלבית המשלבת את תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. לאחר בדיקת האיכות של ההשעיה של תא בודד, מצאנו כי הוא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. יתר על כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (82070450 ל- C.T.and 82170466 ל- L.Z.) ומלגת הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (7121102223 ל- F.L).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
- Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).
- Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).
- Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).
- Rohlenova, K., et al. Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis. Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).
- Ren, X., et al. Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment. Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).
- Sun, H., Xu, X., Deng, C. Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands. Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).
- Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis. Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).
- Thomson, B., Quaggin, S. Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle. Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).
- Leale, D. M., et al. A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).
- Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta. Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator. Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).
- You, Y., et al. Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows. Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).
- Gao, X. -. F., et al. Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).
- Kumar, S., et al. Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments. Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).
