एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए माउस कैरोटिड धमनियों से एकल-सेल निलंबन की तैयारी
Summary
यहाँ हम माउस मन्या धमनियों के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक दो कदम सेल पाचन प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
कैरोटिड धमनियां गर्दन में प्रमुख रक्त वाहिकाएं होती हैं जो मस्तिष्क को रक्त और ऑक्सीजन की आपूर्ति करती हैं, लेकिन कैरोटिड स्टेनोसिस तब होता है जब कैरोटिड धमनियां पट्टिका से भरी होती हैं। एकल कोशिका स्तर पर मन्या धमनी के सेलुलर संरचना का खुलासा मन्या atherosclerosis के इलाज के लिए आवश्यक है. हालांकि, मन्या धमनियों से एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए कोई तैयार करने के लिए उपयोग प्रोटोकॉल नहीं है. कोशिकाओं को कम नुकसान के साथ एकल-कोशिका स्तर पर सामान्य कैरोटिड धमनियों के पृथक्करण के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल प्राप्त करने के लिए, हमने कोलेजनेज/डीएनएएस और ट्रिप्सिन की पाचन प्रक्रिया को एकीकृत करके दो-चरणीय पाचन विधि तैयार की है। एक्रिडिन ऑरेंज/प्रोपिडियम आयोडाइड (एओ/पीआई) दोहरी प्रतिदीप्ति गिनती सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह पाया गया कि एकल सेल निलंबन 85% से अधिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता और एक उच्च सेल एकाग्रता के साथ, एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को संतुष्ट. एकल सेल डाटा प्रोसेसिंग के बाद, प्रत्येक मन्या धमनी सेल में प्रति सेल ~ 2500 टेप का एक औसत पाया गया. विशेष रूप से, सामान्य कैरोटिड धमनी के विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार, जिनमें संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (वीएसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएं (एम φ / डीसी) शामिल हैं, समवर्ती रूप से पता लगाने योग्य थे। इस प्रोटोकॉल उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों से रक्त वाहिकाओं के एक एकल कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
एथेरोस्क्लेरोसिस एक पुरानी सूजन की बीमारी है जो उच्च रक्तचाप, हाइपरलिपिडिमिया और हेमोडायनामिक्स जैसे जोखिम कारकों सेजुड़ी है। कैरोटिड धमनी द्विभाजन हेमोडायनामिक परिवर्तनों से ग्रस्त हैं और कैरोटिड पट्टिका गठन की ओर ले जाते हैं। मन्या atherosclerosis के नैदानिक प्रस्तुति इस तरह के स्ट्रोक और क्षणिक मस्तिष्क ischemia के रूप में तीव्र हो सकता है, या आवर्तक क्षणिक मस्तिष्क ischemia और संवहनी मनोभ्रंश2 के रूप में पुरानी हो सकता है. यंत्रवत्, मन्या पट्टिका रोग स्थितियों के तहत विभिन्न पोत दीवार कोशिकाओं और विभिन्न रक्त कोशिकाओं के बीच बातचीत का परिणाम है। इसलिए, शारीरिक और रोग शर्तों के तहत मन्या जहाजों के एकल सेल एटलस का खुलासा मन्या पट्टिका विकास को रोकने और इलाज के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैविक अनुसंधान की सबसे शक्तिशाली प्रौद्योगिकियों में से एक है क्योंकि इसके अल्ट्राहाई रिज़ॉल्यूशन और एक ही सेल प्रकार के जीवों से सेल विषमता का पतालगाने के लिए 3,4. शोधकर्ताओं ने कई क्षेत्रों में अनुसंधान करने के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण का उपयोग किया है, जैसे हृदय रोग5 और कैंसर6। हालांकि, एकल कोशिकाओं में ऊतकों को जल्दी और सटीक रूप से अलग करना अभी भी मुख्य चुनौतियों में से एक है। एंजाइमेटिक पृथक्करण एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जिसमें मुख्य रूप से कोलेजनेज, पपैन, ट्रिप्सिन, डीएनेज और हाइलूरोनिडेस शामिल हैं। विशेष रूप से, कोलेजेनेस एकल-कोशिका पाचन के लिए प्रमुख एंजाइम प्रजातियां हैं, मुख्य रूप से संयोजी ऊतकों में कोलेजन घटकों को हाइड्रोलाइज़ करना। विभिन्न कोलेजन प्रकार विभिन्न ऊतकों के पृथक्करण के लिए लागू होते हैं, जैसे स्तन ग्रंथि7, ग्लोमेरुलस8, इरिडोकोर्नियल कोण9, घुटने का जोड़ 10, महाधमनी11 और फेफड़े12। विभिन्न ऊतकों के अद्वितीय शारीरिक गुणों के कारण, एक ही विधि का उपयोग करके पृथक्करण एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने में कई परेशानी पैदा कर सकता है, जैसे कि कम सेल व्यवहार्यता, कम सेल नंबर और बड़े सेल मलबे। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए विभिन्न ऊतकों के लिए पाचन विधियों का आविष्कार आवश्यक है।
इस प्रोटोकॉल जंगली प्रकार चूहों की मन्या धमनी के एक एकल सेल निलंबन तैयार करने के लिए एक दो कदम सेल पाचन विधि विकसित करना है. कैरोटिड धमनी की विशेषताओं के अनुसार, हमने माउस कैरोटिड धमनी के उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए ट्रिप्सिन के साथ कोलेजनेज / डीएनएएस को जोड़ा क्योंकि कोलेजनेज कैरोटिड ऊतकों के कोलेजन को हाइड्रोलाइज कर सकता है, जिसे ट्रिप्सिन द्वारा एकल-कोशिका निलंबन में आगे पचाया गया था। एक्रिडिन ऑरेंज/प्रोपिडियम आयोडाइड (एओ/पीआई) दोहरी प्रतिदीप्ति गिनती सेल व्यवहार्यता और एकाग्रता का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह पाया गया कि एकल सेल निलंबन 85% से अधिक कोशिकाओं की व्यवहार्यता और एक उच्च सेल एकाग्रता के साथ, एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को संतुष्ट. एकल-सेल डेटा प्रोसेसिंग के बाद, पाचन के बाद सामान्य माउस कैरोटिड धमनियों में संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (वीएसएमसी), फाइब्रोब्लास्ट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी), और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाओं (एम φ / डीसी) सहित चार सेल प्रकारों की पहचान की गई थी। इस प्रोटोकॉल के फायदे हैं कि: 1) मन्या धमनी में कई सेल प्रकार की पहचान की जा सकती है, 2) सेल व्यवहार्यता अच्छी तरह से संरक्षित है, और 3) यह आसानी से विशेष उपकरणों के बिना दोहराया जा सकता है. यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो माउस कैरोटिड धमनियों के एकल-कोशिका मल्टीओमिक्स का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। यह प्रोटोकॉल उचित संशोधनों के साथ अन्य रक्त वाहिकाओं के पृथक्करण में भी सहायक हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम जंगली प्रकार के चूहों की कैरोटिड धमनी से उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें कोलेजनेज/डीएनएएस और ट्रिप्सिन की पाचन प्रक्रिया को एकी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070450 से सीटी और 82170466 से एलजेड) और चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (7121102223 से एफएल) की फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
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