Preparazione di una sospensione unicellulare da arterie carotidi di topo per il sequenziamento di singole cellule
Summary
Qui descriviamo un protocollo di digestione cellulare in due fasi per la preparazione di una sospensione unicellulare delle arterie carotidi di topo.
Abstract
Le arterie carotidi sono i principali vasi sanguigni del collo che forniscono sangue e ossigeno al cervello, ma la stenosi carotidea si verifica quando le arterie carotidi sono ostruite dalla placca. Rivelare la composizione cellulare dell’arteria carotide a livello di singola cellula è essenziale per il trattamento dell’aterosclerosi carotidea. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all’uso per la preparazione di sospensioni unicellulari da arterie carotidi. Per ottenere un protocollo adatto per la dissociazione delle arterie carotidi normali a livello di singola cellula con meno danni alle cellule, abbiamo progettato un metodo di digestione in due fasi integrando il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all’85% e un’elevata concentrazione cellulare. Dopo l’elaborazione dei dati di una singola cellula, è stata rilevata una mediana di ~2500 trascritti per cellula in ciascuna cellula dell’arteria carotide. In particolare, una varietà di tipi di cellule della normale arteria carotide, tra cui le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), i fibroblasti, le cellule endoteliali (EC) e i macrofagi e le cellule dendritiche (Mφ/DC), erano rilevabili contemporaneamente. Questo protocollo può essere applicato per preparare una sospensione unicellulare di vasi sanguigni di altri tessuti con opportune modifiche.
Introduction
L’aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica associata a fattori di rischio come l’ipertensione, l’iperlipidemia e l’emodinamica1. Le biforcazioni dell’arteria carotide sono soggette a cambiamenti emodinamici e portano alla formazione di placche carotidi. La presentazione clinica dell’aterosclerosi carotidea può essere acuta, come ictus e ischemia cerebrale transitoria, o cronica, come ischemia cerebrale transitoria ricorrente e demenza vascolare2. Meccanicamente, la placca carotidea è il risultato dell’interazione tra diverse cellule della parete dei vasi e varie cellule del sangue in condizioni patologiche. Pertanto, rivelare l’atlante unicellulare dei vasi carotidei in condizioni fisiologiche e patologiche è particolarmente importante per prevenire e trattare lo sviluppo della placca carotidea.
Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula è una delle tecnologie più potenti della ricerca biologica grazie alla sua altissima risoluzione e al rilevamento dell’eterogeneità cellulare dallo stesso tipo di cellule di organismi 3,4. I ricercatori hanno utilizzato il sequenziamento dell’RNA a singola cellula per condurre ricerche in molti campi, come le malattie cardiovascolari5 e il cancro6. Tuttavia, separare in modo rapido e accurato i tessuti in singole cellule è ancora una delle sfide principali. La dissociazione enzimatica è un metodo comunemente usato che include prevalentemente collagenasi, papaina, tripsina, DNasi e ialuronidasi. In particolare, le collagenasi sono le principali specie enzimatiche per la digestione unicellulare, principalmente idrolizzando i componenti del collagene nei tessuti connettivi. Diversi tipi di collagenasi sono applicabili per la dissociazione di diversi tessuti, come la ghiandola mammaria7, il glomerulo8, l’angolo iridocorneale9, l’articolazione del ginocchio10, l’aorta 11 e il polmone12. A causa delle proprietà fisiologiche uniche dei diversi tessuti, la dissociazione con lo stesso metodo può causare molti problemi nell’acquisizione di singole cellule, come bassa vitalità cellulare, basso numero di cellule e detriti cellulari di grandi dimensioni. Pertanto, l’invenzione di metodi di digestione per diversi tessuti è essenziale per preparare sospensioni unicellulari di alta qualità.
Questo protocollo mira a sviluppare un metodo di digestione cellulare in due fasi per preparare una sospensione unicellulare dell’arteria carotide di topi wild-type. In base alle caratteristiche dell’arteria carotide, abbiamo combinato la collagenasi/DNasi con la tripsina per ottenere una sospensione unicellulare di alta qualità dell’arteria carotide del topo perché la collagenasi può idrolizzare il collagene dei tessuti carotidi, che è stato ulteriormente digerito dalla tripsina in una sospensione unicellulare. Per rilevare la vitalità e la concentrazione delle cellule è stato utilizzato il conteggio a doppia fluorescenza di arancia acridina/ioduro di propidio (AO/PI) ed è stato riscontrato che la sospensione a singola cellula soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all’85% e un’elevata concentrazione cellulare. Dopo l’elaborazione dei dati a singola cellula, quattro tipi di cellule, tra cui cellule muscolari lisce vascolari (VSMC), fibroblasti, cellule endoteliali (EC) e macrofagi e cellule dendritiche (Mφ/DC), sono stati identificati nelle arterie carotidi di topo normali dopo la digestione. I vantaggi di questo protocollo sono che: 1) è possibile identificare più tipi di cellule nell’arteria carotide, 2) la vitalità cellulare è ben preservata e 3) può essere facilmente ripetuto senza apparecchiature speciali. Questo protocollo è adatto ai ricercatori interessati a studiare la multiomica a singola cellula delle arterie carotidi di topo. Questo protocollo può anche essere utile nella dissociazione di altri vasi sanguigni con opportune modifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall’arteria carotide di topi wild-type, in cui è stato costruito un metodo di digestione in due fasi che integra il processo di digestione della collagenasi/DNasi e della tripsina. Dopo il controllo di qualità della sospensione a singola cellula, abbiamo scoperto che soddisfaceva i requisiti per il sequenziamento a singola cellula, con una vitalità delle cellule superiore all’85% e un’elevata concentrazione cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (82070450 a C.T. e 82170466 a L.Z.) e dalla borsa di studio della China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 a F.L.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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