シングルセルシーケンシングのためのマウス頸動脈からのシングルセル懸濁液の調製
Summary
ここでは、マウス頸動脈の単一細胞懸濁液を調製するための2段階の細胞消化プロトコルについて説明します。
Abstract
頸動脈は、脳に血液と酸素を供給する首の主要な血管ですが、頸動脈がプラークで詰まると頸動脈狭窄症が起こります。頸動脈の細胞組成を単一細胞レベルで明らかにすることは、頸動脈アテローム性動脈硬化症の治療に不可欠です。しかし、頸動脈からの単一細胞懸濁液を調製するためのすぐに使用できるプロトコルはありません。細胞へのダメージを抑えながら、単一細胞レベルで正常な頸動脈を解離させるのに適したプロトコルを得るために、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合することにより、2段階の消化法を設計しました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。単一細胞のデータ処理後、各頸動脈細胞で細胞あたり中央値~2500の転写産物が検出されました。特に、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)など、正常な頸動脈のさまざまな細胞タイプが同時に検出可能でした。このプロトコルは適切な修正の他のティッシュからの血管の単一細胞懸濁液を準備するのに適用されてもよい。
Introduction
アテローム性動脈硬化症は、高血圧、高脂血症、血行動態などの危険因子に関連する慢性炎症性疾患です1。頸動脈分岐部は血行動態の変化を起こしやすく、頸動脈プラークの形成につながります。頸動脈アテローム性動脈硬化症の臨床症状は、脳卒中や一過性脳虚血などの急性の場合もあれば、再発性一過性脳虚血や血管性認知症などの慢性の場合もある2。機械的には、頸動脈プラークは、病理学的条件下での異なる血管壁細胞と様々な血液細胞との間の相互作用の結果である。したがって、生理学的および病理学的条件下で頸動脈血管の単一細胞アトラスを明らかにすることは、頸動脈プラークの発生を予防および治療するために特に重要です。
シングルセルRNAシーケンシングは、超高分解能で同じ細胞型の生物由来の細胞の不均一性を検出できるため、生物学研究において最も強力な技術の1つです3,4。研究者は、心血管疾患5やがん6など、多くの分野で研究を行うためにシングルセルRNAシーケンシングを使用してきました。しかし、組織を迅速かつ正確に単一細胞に分離することは、依然として主要な課題の1つです。酵素解離は、コラゲナーゼ、パパイン、トリプシン、DNase、ヒアルロニダーゼを主に含む一般的に使用される方法です。具体的には、コラゲナーゼは単一細胞消化の主要な酵素種であり、主に結合組織のコラーゲン成分を加水分解します。乳腺7、糸球体8、虹彩角膜角9、膝関節10、大動脈11、肺12など、異なる種類のコラゲナーゼが異なる組織の解離に適用可能である。異なる組織の特異な生理学的特性により、同じ方法で解離すると、細胞生存率の低下、細胞数の減少、細胞破片の多大化など、単一細胞の獲得に多くの問題が発生する可能性があります。したがって、異なる組織に対する消化法の発明は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。
このプロトコルは野生型マウスの頸動脈の単一セル懸濁液を準備するために二段階のセル消化力方法を開発することを向ける。コラゲナーゼは頸動脈組織のコラーゲンを加水分解し、さらにトリプシンで消化して単細胞懸濁液となるため、頸動脈の特性に応じて、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンを組み合わせ、マウス頸動脈の高品質な単細胞懸濁液を得ました。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)の二重蛍光計数を使用して細胞の生存率と濃度を検出したところ、単一細胞懸濁液は、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、単一細胞シーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。シングルセルデータ解析の結果、消化後の正常なマウス頸動脈において、血管平滑筋細胞(VSMC)、線維芽細胞、内皮細胞(EC)、マクロファージおよび樹状細胞(Mφ/DC)の4種類の細胞が同定されました。このプロトコルの利点は、1)頸動脈の複数の細胞タイプを識別でき、2)細胞生存率がよく維持され、3)特別な機器なしで簡単に繰り返すことができます。このプロトコルは、マウス頸動脈の単一細胞マルチオミクスの研究に関心のある研究者に適しています。このプロトコルは、適切な修正を施すことで他の血管を解離させることにも役立つ可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、野生型マウスの頸動脈から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための詳細なプロトコルを提供し、コラゲナーゼ/DNaseとトリプシンの消化プロセスを統合した2段階の消化法を構築しました。シングルセル懸濁液の品質チェックの結果、細胞の生存率が85%を超え、細胞濃度が高いため、シングルセルシーケンシングの要件を満たしていることがわかりました。さらに、頸動脈のVSMC、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国自然科学基金会(82070450 to C.T.および82170466 to L.Z.)およびChina Postdoctoral Science Foundation(7121102223 to F.L.)のフェローシップからの助成金によって支援されました。
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
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