Här beskriver vi ett tvåstegs cellmatsmältningsprotokoll för att förbereda en encellssuspension av musens halspulsåder.
Halspulsådrorna är stora blodkärl i halsen som förser hjärnan med blod och syre, men karotisstenos uppstår när halspulsådrorna täpps till av plack. Att avslöja den cellulära sammansättningen av halspulsådern på encellsnivå är viktigt för behandling av karotisateroskleros. Det finns dock inget färdigt protokoll för beredning av encellssuspensioner från halspulsådern. För att få ett lämpligt protokoll för dissociation av normala halspulsådror på encellsnivå med mindre skador på cellerna, utformade vi en tvåstegs matsmältningsmetod genom att integrera matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med en cell detekterades en median på ~2500 transkript per cell i varje halspulsådercell. Noterbart är att en mängd olika celltyper i den normala halspulsådern, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), kunde detekteras samtidigt. Detta protokoll kan användas för att bereda en encellssuspension av blodkärl från andra vävnader med lämpliga modifieringar.
Åderförkalkning är en kronisk inflammatorisk sjukdom förknippad med riskfaktorer som högt blodtryck, hyperlipidemi och hemodynamik1. Halspulsåderns förgreningar är benägna att drabbas av hemodynamiska förändringar och leder till att plack bildas i halspulsådern. Den kliniska presentationen av karotisateroskleros kan vara akut såsom stroke och övergående cerebral ischemi, eller kronisk såsom återkommande övergående cerebral ischemi och vaskulär demens2. Mekaniskt är karotisplack resultatet av interaktionen mellan olika kärlväggsceller och olika blodceller under patologiska förhållanden. Därför är det särskilt viktigt att avslöja den encelliga atlasen över karotiskärl under fysiologiska och patologiska förhållanden för att förebygga och behandla utvecklingen av karotisplack.
Encells-RNA-sekvensering är en av de mest kraftfulla teknikerna inom biologisk forskning på grund av dess ultrahöga upplösning och detektion av cellheterogenitet från samma celltyp av organismer 3,4. Forskare har använt encells-RNA-sekvensering för att bedriva forskning inom många områden, till exempel hjärt-kärlsjukdom5 och cancer6. Att snabbt och exakt separera vävnader till enskilda celler är dock fortfarande en av de största utmaningarna. Enzymatisk dissociation är en vanligt förekommande metod som främst inkluderar kollagenas, papain, trypsin, DNas och hyaluronidas. Kollagenaser är de viktigaste enzymerna för encellig matsmältning, främst hydrolyserande kollagenkomponenter i bindväv. Olika kollagenastyper är tillämpliga för dissociation av olika vävnader, såsom bröstkörteln7, glomerulus8, iridohornhinnans vinkel9, knäled 10, aorta11 och lunga12. På grund av de unika fysiologiska egenskaperna hos olika vävnader kan dissociation med samma metod orsaka många problem med att förvärva enstaka celler, såsom låg cellviabilitet, lågt cellantal och stora cellrester. Därför är uppfinningen av matsmältningsmetoder för olika vävnader avgörande för att framställa högkvalitativa encellssuspensioner.
Detta protokoll syftar till att utveckla en tvåstegs cellsmältningsmetod för att förbereda en encellssuspension av halspulsådern hos vildtypsmöss. Enligt egenskaperna hos halspulsådern kombinerade vi kollagenas/DNas med trypsin för att få en högkvalitativ encellssuspension av mössens halspulsåder eftersom kollagenas kan hydrolysera kollagen i halspulsådern, som smältes vidare av trypsin till en encellssuspension. Dubbelfluorescensräkning av akridinorange/propidiumjodid (AO/PI) användes för att detektera cellviabilitet och koncentration, och det visade sig att encellssuspensionen uppfyllde kraven för encellssekvensering, med cellviabilitet över 85 % och en hög cellkoncentration. Efter databehandling med enskilda celler identifierades fyra celltyper, inklusive vaskulära glatta muskelceller (VSMC), fibroblaster, endotelceller (EC) och makrofager och dendritiska celler (Mφ/DC), i normala halspulsådror hos möss efter matsmältning. Fördelarna med detta protokoll är att: 1) flera celltyper i halspulsådern kan identifieras, 2) cellviabiliteten är väl bevarad och 3) den kan enkelt upprepas utan specialutrustning. Detta protokoll är lämpligt för forskare som är intresserade av att studera encelliga multiomiker i mössens halspulsåder. Detta protokoll kan också vara till hjälp vid dissociation av andra blodkärl med lämpliga modifieringar.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för beredning av en högkvalitativ encellssuspension från halspulsådern hos vildtypsmöss, där en tvåstegs matsmältningsmetod som integrerar matsmältningsprocessen av kollagenas/DNas och trypsin konstruerades. Efter kvalitetskontrollen av encellssuspensionen fann vi att den uppfyllde kraven för encellssekvensering, med en livskraft på över 85 % och en hög cellkoncentration. Dessutom upptäcktes en mängd olika celltyper i halspulsådern, inklusive VSMC, fibrobl…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Natural Science Foundation of China (82070450 till C.T. och 82170466 till L.Z.) och stipendiet från China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 till F.L.).
0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |