Burada, fare karotis arterlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim protokolünü açıklıyoruz.
Karotis arterler, boyundaki beyne kan ve oksijen sağlayan ana kan damarlarıdır, ancak karotis arterleri plak tarafından tıkandığında karotis darlığı meydana gelir. Karotis arterin hücresel bileşiminin tek hücre düzeyinde ortaya çıkarılması, karotis aterosklerozunun tedavisi için esastır. Bununla birlikte, karotis arterlerden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Normal karotis arterlerin tek hücre düzeyinde hücrelere daha az zarar vererek ayrışması için uygun bir protokol elde etmek için, kollajenaz/DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre ederek iki aşamalı bir sindirim yöntemi tasarladık. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85’in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, her karotis arter hücresinde hücre başına ortalama ~ 2500 transkript tespit edildi. Özellikle, vasküler düz kas hücreleri (VSMC’ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC’ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC’ler) dahil olmak üzere normal karotis arterin çeşitli hücre tipleri aynı anda tespit edilebilirdi. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer dokulardan kan damarlarının tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için uygulanabilir.
Ateroskleroz, yüksek tansiyon, hiperlipidemi ve hemodinamik gibi risk faktörleriyle ilişkili kronik inflamatuar bir hastalıktır1. Karotis arter bifurkasyonları hemodinamik değişikliklere eğilimlidir ve karotis plak oluşumuna yol açar. Karotis aterosklerozunun klinik prezentasyonu inme ve geçici serebral iskemi gibi akut veya tekrarlayan geçici serebral iskemi ve vasküler demans gibi kronik olabilir2. Mekanik olarak karotis plak, patolojik koşullar altında farklı damar duvarı hücreleri ve çeşitli kan hücreleri arasındaki etkileşimin sonucudur. Bu nedenle, fizyolojik ve patolojik koşullar altında karotis damarlarının tek hücreli atlasının ortaya çıkarılması, karotis plak gelişiminin önlenmesi ve tedavisi için özellikle önemlidir.
Tek hücreli RNA dizilimi, ultra yüksek çözünürlüğü ve aynı hücre tipi organizmalardan hücre heterojenliğinin tespiti nedeniyle biyolojik araştırmaların en güçlü teknolojilerinden biridir 3,4. Araştırmacılar, kardiyovasküler hastalık5 ve kanser6 gibi birçok alanda araştırma yapmak için tek hücreli RNA dizilimini kullandılar. Bununla birlikte, dokuları hızlı ve doğru bir şekilde tek hücrelere ayırmak hala ana zorluklardan biridir. Enzimatik ayrışma, baskın olarak kollajenaz, papain, tripsin, DNaz ve hyaluronidaz içeren yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Spesifik olarak, kollajenazlar, tek hücreli sindirim için ana enzim türleridir ve esas olarak bağ dokularındaki kollajen bileşenlerini hidrolize eder. Meme bezi7, glomerulus8, iridokorneal açı9, diz eklemi10, aort11 ve akciğer12 gibi farklı dokuların ayrışması için farklı kollajenaz tipleri uygulanabilir. Farklı dokuların benzersiz fizyolojik özellikleri nedeniyle, aynı yöntemi kullanarak ayrışma, düşük hücre canlılığı, düşük hücre sayısı ve büyük hücre kalıntıları gibi tek hücrelerin elde edilmesinde birçok soruna neden olabilir. Bu nedenle, farklı dokular için sindirim yöntemlerinin icadı, yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için gereklidir.
Bu protokol, vahşi tip farelerin karotis arterinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için iki aşamalı bir hücre sindirim yöntemi geliştirmeyi amaçlamaktadır. Karotis arterin özelliklerine göre, fare karotis arterinin yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için kollajenaz / DNazı tripsin ile birleştirdik çünkü kollajenaz, tripsin tarafından daha fazla sindirilen karotis dokularının kollajenini hidrolize edebilir. Hücre canlılığını ve konsantrasyonunu tespit etmek için akridin turuncu/propidyum iyodür (AO/PI) çift floresan sayımı kullanıldı ve tek hücreli süspansiyonun, hücrelerin canlılığı ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığı, hücrelerin %85’in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu olduğu bulundu. Tek hücreli veri işlemeden sonra, sindirimden sonra normal fare karotis arterlerinde vasküler düz kas hücreleri (VSMC’ler), fibroblastlar, endotel hücreleri (EC’ler) ve makrofajlar ve dendritik hücreler (Mφ / DC’ler) dahil olmak üzere dört hücre tipi tanımlandı. Bu protokolün avantajları şunlardır: 1) karotis arterdeki çoklu hücre tipleri tanımlanabilir, 2) hücre canlılığı iyi korunur ve 3) özel ekipman olmadan kolayca tekrarlanabilir. Bu protokol, fare karotis arterlerinin tek hücreli multiomiklerini incelemek isteyen araştırmacılar için uygundur. Bu protokol, uygun modifikasyonlarla diğer kan damarlarının ayrışmasında da yardımcı olabilir.
Burada, kollajenaz / DNaz ve tripsinin sindirim sürecini entegre eden iki aşamalı bir sindirim yönteminin oluşturulduğu vahşi tip farelerin karotis arterinden yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Tek hücreli süspansiyonun kalite kontrolünden sonra, hücrelerin %85’in üzerinde canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşıladığını gördük. Ayrıca, tek hücreli veri işlemeden sonra VSMC…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (82070450’den CT’ye ve 82170466’dan NZ’ye) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı’nın (7121102223’den FL’ye) burslarıyla desteklenmiştir.
0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |