がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立
Summary
このプロトコルは、ハイスループットの基礎およびトランスレーショナルヒトがん研究を実行し、薬物スクリーニング、疾患モデリング、および個別化医療アプローチを進歩させるための生理学的に関連性のある腫瘍オンチップモデルを提示し、ローディング、メンテナンス、および評価手順を説明します。
Abstract
固形がんの腫瘍微小環境を in vitro で再現する検証済みのがんモデルの欠如は、前臨床がん研究および治療法開発の大きなボトルネックのままです。この問題を解決するために、私たちは、複雑なヒトの腫瘍微小環境を現実的にモデル化する微小生理学的システムである血管新生微小腫瘍(VMT)、または腫瘍チップを開発しました。VMTは、動的で生理学的フロー条件下で複数のヒト細胞タイプを共培養することにより、マイクロ流体プラットフォーム内で de novo を形成します。この組織工学的微小腫瘍コンストラクトは、生体内で新たに形成された血管と同様に、成長する腫瘍量をサポートする生きた灌流血管ネットワークを組み 込んでいます。重要なことは、薬物や免疫細胞が腫瘍に到達するには内皮層を通過する必要があり、治療の送達と有効性に対する in vivo の生理学的障壁をモデル化することです。VMTプラットフォームは光学的に透過性であるため、組織内の蛍光標識細胞を直接可視化することで、免疫細胞の血管外漏出や転移などの動的プロセスの高解像度イメージングを実現できます。さらに、VMTは、 in vivo 腫瘍の不均一性、遺伝子発現シグネチャー、および薬物応答を保持します。ほぼすべての腫瘍タイプをプラットフォームに適応させることができ、新鮮な手術組織からの初代細胞が増殖し、VMTでの薬物治療に反応し、真に個別化された医療への道を開きます。ここでは、VMTを確立し、腫瘍学研究に活用するための方法について概説します。この革新的なアプローチは、腫瘍と薬物反応の研究に新たな可能性を開き、研究者にがん研究を前進させるための強力なツールを提供します。
Introduction
がんは依然として世界的に大きな健康上の懸念事項であり、米国では死因の第2位となっています。国立保健統計センターは、2023年だけでも、米国で190万人以上の新規がん患者と60万人以上のがん死亡者が発生すると予想しており1、効果的な治療アプローチの緊急の必要性が浮き彫りになっています。しかし、現在、臨床試験に入った抗がん剤のうち、最終的にFDAの承認を得るのはわずか5.1%です。有望な候補が臨床試験を成功裏に進められないのは、前臨床医薬品開発中に2D培養やスフェロイド培養などの非生理学的モデルシステムを使用することに部分的に起因している可能性があります2。これらの古典的ながんモデルには、治療抵抗性や疾患進行の重要な決定要因である間質ニッチ、関連する免疫細胞、灌流血管系など、腫瘍微小環境の本質的な構成要素が欠けています。したがって、前臨床所見の臨床的翻訳を改善するためには、ヒト のin vivo 腫瘍微小環境をよりよく模倣する新しいモデルシステムが必要です。
組織工学の分野は急速に進歩しており、実験室でヒトの疾患を研究するためのより良い方法を提供しています。重要な進展の1つは、臓器チップまたは組織チップとしても知られる微小生理学的システム(MPS)の出現であり、これは、健康な状態または病気の状態を再現できる機能的で小型化された人間の臓器です3,4,5。これに関連して、3次元マイクロ流体ベースのin vitroヒト腫瘍モデルである腫瘍チップが、腫瘍学研究用に開発されました2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .これらの高度なモデルは、動的な腫瘍微小環境内に生化学的および生物物理学的な手がかりを組み込んでおり、研究者はより生理学的に適切な状況で腫瘍の挙動と治療への反応を研究することができます。しかし、これらの進歩にもかかわらず、生きた機能的な血管系、特に生理学的流れに応答して自己パターン化する血管系をうまく組み込んだグループはほとんどありません3,4,5,6。機能的な血管ネットワークを含めることは、薬物や細胞の送達、異なる微小環境への細胞のホーミング、腫瘍細胞、間質細胞、免疫細胞の経内皮的移動に影響を与える物理的障壁のモデル化を可能にするため、非常に重要です。この特徴を含むことにより、腫瘍チップは、in vivo腫瘍微小環境で観察される複雑さをよりよく表現することができる。
このアンメットニーズに応えるため、マイクロ流体デバイス内で微小血管ネットワークを形成できる新しい薬物スクリーニングプラットフォームを開発しました8,9,10,11,12,13,14,15,16。血管新生マイクロオルガン(VMO)と呼ばれるこのベース臓器チッププラットフォームは、ほぼすべての臓器システムに適合させて、疾患モデリング、薬物スクリーニング、個別化医療アプリケーションのために元の組織生理学を再現することができます。VMOは、内皮コロニー形成細胞由来内皮細胞(ECFC-EC)、HUVEC、IPSC-EC(以下EC)と、マトリックスをリモデリングする正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF)や血管を包み込んで安定化させる周皮細胞など、チャンバー内の複数の間質細胞を共培養することによって成立します。VMOは、腫瘍細胞と関連する間質を共培養して血管新生微小腫瘍(VMT)8,9,10,11,12,13、または腫瘍チップモデルを作成することにより、がんモデルシステムとして確立することもできます。ダイナミックフロー環境における複数の細胞タイプの共培養を通じて、灌流微小血管ネットワークはデバイスの組織チャンバー内にde novoを形成し、そこで血管新生は間質流量によって密接に調節される14,15。培地は、in vivoの毛細血管に見られるものと同様に、1.2 x 10-7 cm / sの透過係数で、微小血管を介してのみ組織チャンバーの周囲の細胞に栄養素を供給する静水圧ヘッドによってデバイスのマイクロ流体チャネルを介して駆動されます8。
自己組織化微小血管のVMTモデルへの組み込みは、次の理由から重要なブレークスルーを表しています:1)in vivoでの血管新生腫瘍塊の構造と機能を模倣します。2)腫瘍と内皮および間質細胞の相互作用を含む転移の重要なステップをモデル化できます。3)栄養素と薬物送達のための生理学的に選択的な障壁を確立し、医薬品スクリーニングを改善します。4)抗血管新生および抗転移能力を有する薬物の直接評価を可能にする。VMO/VMTプラットフォームは、複雑な3D微小環境において栄養素、薬物、免疫細胞のin vivo送達を再現することにより、薬物スクリーニングの実施や、がん、血管、臓器特異的な生物学の研究に使用できる生理学的に関連性の高いモデルです。重要なことに、VMTは、結腸がん、黒色腫、乳がん、膠芽腫、肺がん、腹膜がん、卵巣がん、膵臓がんなど、さまざまな種類の腫瘍の成長をサポートします8,9,10,11,12,13。マイクロ流体プラットフォームは、低コストで、簡単に確立でき、ハイスループット実験用に配列できることに加えて、腫瘍間質相互作用のリアルタイム画像解析や、刺激や治療薬に対する反応に完全に光学的に対応しています。システム内の各細胞タイプは、異なる蛍光マーカーで標識されており、実験全体を通して細胞の挙動を直接可視化および追跡することができ、動的な腫瘍微小環境への窓を作成します。VMTは、標準的な培養モダリティよりもin vivoでの腫瘍増殖、構造、不均一性、遺伝子発現シグネチャー、および薬物応答をより忠実にモデル化することを以前に示しました10。重要なことに、VMTは、がん細胞を含む患者由来細胞の増殖と研究をサポートし、標準的なスフェロイド培養よりも親腫瘍の病理学をよりよくモデル化し、個別化医療の取り組みをさらに前進させます11。この原稿では、VMTを確立するための方法を概説し、ヒトのがんを研究するためのVMTの有用性を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
体内のほぼすべての組織が血管系を通じて栄養素と酸素を受け取るため、in vitroでの現実的な疾患モデリングと薬物スクリーニングに不可欠な要素となっています。さらに、いくつかの悪性腫瘍と病態は、血管内皮機能障害と透過性亢進によって定義されます3。特に、がんでは、腫瘍関連の血管系はしばしば灌流が悪く、破壊され、漏出しているため、腫瘍への治療?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christopher Hughes博士の研究室のメンバーには、説明されている手順に貴重な意見を寄せていただき、Abraham Lee博士の研究室の共同研究者には、プラットフォームの設計と製造を支援していただいたことに感謝します。この研究は、UG3/UH3 TR002137、R61/R33 HL154307、1R01CA244571、1R01 HL149748、U54 CA217378 (CCWH)、TL1 TR001415 and W81XWH2110393 (SJH)の助成金によって支援されました。
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
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