Создание физиологической васкуляризированной модели микроопухоли человека для исследования рака
Summary
Этот протокол представляет собой физиологически релевантную модель опухоли на чипе для выполнения высокопроизводительных фундаментальных и трансляционных исследований рака человека, продвижения скрининга лекарств, моделирования заболеваний и персонализированной медицины с описанием процедур загрузки, поддержания и оценки.
Abstract
Отсутствие валидированных моделей рака, которые повторяют опухолевое микроокружение солидных раковых опухолей in vitro , остается серьезным препятствием для доклинических исследований рака и терапевтических разработок. Чтобы решить эту проблему, мы разработали васкуляризированную микроопухоль (VMT), или опухолевый чип, микрофизиологическую систему, которая реалистично моделирует сложное микроокружение опухоли человека. VMT формируется de novo в микрофлюидной платформе путем совместного культивирования нескольких типов клеток человека в динамических, физиологических условиях потока. Эта тканеинженерная микроопухолевая конструкция включает в себя живую перфузионную сосудистую сеть, которая поддерживает растущую опухолевую массу так же, как это делают новообразованные сосуды in vivo. Важно отметить, что лекарственные препараты и иммунные клетки должны пересекать эндотелиальный слой, чтобы достичь опухоли, моделируя in vivo физиологические барьеры для терапевтической доставки и эффективности. Поскольку платформа VMT оптически прозрачна, визуализация динамических процессов, таких как экстравазация иммунных клеток и метастазирование, может быть достигнута с помощью прямой визуализации флуоресцентно меченных клеток в ткани. Кроме того, VMT сохраняет гетерогенность опухоли in vivo , сигнатуры экспрессии генов и реакцию на лекарственные препараты. Практически любой тип опухоли может быть адаптирован к платформе, а первичные клетки из свежих хирургических тканей растут и реагируют на медикаментозное лечение в VMT, прокладывая путь к по-настоящему персонализированной медицине. Описаны методы создания ВМТ и его использования для онкологических исследований. Этот инновационный подход открывает новые возможности для изучения опухолей и реакции на лекарственные препараты, предоставляя исследователям мощный инструмент для продвижения исследований рака.
Introduction
Рак остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире и является второй по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Только на 2023 год Национальный центр статистики здравоохранения прогнозирует более 1,9 миллиона новых случаев заболевания раком и более 600 000 смертей от рака вСША1, что подчеркивает острую необходимость в эффективных подходах к лечению. Тем не менее, в настоящее время только 5,1% противоопухолевых препаратов, участвующих в клинических испытаниях, в конечном итоге получают одобрение FDA. Неспособность перспективных кандидатов успешно пройти клинические испытания может быть частично связана с использованием нефизиологических модельных систем, таких как 2D и сфероидные культуры, во время доклиническойразработки лекарственных средств. В этих классических моделях рака отсутствуют важнейшие компоненты микроокружения опухоли, такие как стромальная ниша, ассоциированные иммунные клетки и перфузионная сосудистая сеть, которые являются ключевыми детерминантами терапевтической резистентности и прогрессирования заболевания. Таким образом, для улучшения клинической трансляции доклинических результатов необходима новая модельная система, которая лучше имитирует микроокружение опухоли человека in vivo .
Область тканевой инженерии быстро развивается, предлагая более совершенные методы изучения заболеваний человека в лабораторных условиях. Одним из важных достижений является появление микрофизиологических систем (МПС), также известных как органные чипы или тканевые чипы, которые представляют собой функциональные, миниатюрные человеческие органы, способные воспроизводить здоровые или больныесостояния. В этом контексте для онкологических исследований были разработаны опухолевые чипы, представляющие собой трехмерные микрофлюидные модели опухолей человека in vitro 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Эти усовершенствованные модели включают биохимические и биофизические сигналы в динамическом микроокружении опухоли, что позволяет исследователям изучать поведение опухоли и реакцию на лечение в более физиологически релевантном контексте. Однако, несмотря на эти достижения, лишь немногим группам удалось успешно внедрить живую, функциональную сосудистую сеть, особенно ту, которая самоанализируется в ответ на физиологический поток 3,4,5,6. Включение функциональной сосудистой сети имеет решающее значение, поскольку позволяет моделировать физические барьеры, влияющие на доставку лекарств или клеток, наведение клеток в различные микроокружения и трансэндотелиальную миграцию опухолевых, стромальных и иммунных клеток. Благодаря этой функции опухолевый чип может лучше представить сложности, наблюдаемые в микроокружении опухоли in vivo.
Чтобы удовлетворить эту неудовлетворенную потребность, мы разработали новую платформу для скрининга лекарственных средств, которая позволяет формировать сети микрососудов внутри микрофлюидного устройства 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Эта базовая платформа органного чипа, называемая васкуляризированным микроорганом (VMO), может быть адаптирована практически к любой системе органов для воспроизведения оригинальной физиологии тканей для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и применения персонализированной медицины. ВМО устанавливаются путем совместного культивирования эндотелиальных колониеобразующих клеток эндотелиального происхождения (ECFC-EC), HUVEC или iPSC-EC (далее EC) и нескольких стромальных клеток в камере, включая нормальные фибробласты легких человека (NHLF), которые ремоделируют матрикс, и перициты, которые оборачивают и стабилизируют сосуды. VMO также может быть установлена в качестве системы модели рака путем совместного культивирования опухолевых клеток с ассоциированной стромой для создания васкуляризированной микроопухоли (VMT)8,9,10,11,12,13 или модели опухолевого чипа. Благодаря совместному культивированию нескольких типов клеток в среде динамического потока, перфузионные микрососудистые сети формируются de novo в тканевых камерах устройства, где васкулогенез строго регулируется скоростями интерстициального потока14,15. Среда прогоняется по микрофлюидным каналам устройства гидростатической напорной головкой, которая снабжает окружающие клетки тканевой камеры питательными веществами исключительно через микрососуды, с коэффициентом проницаемости 1,2 х 10-7 см/с, аналогично тому, что наблюдается для капилляров in vivo8.
Включение самоорганизующихся микрососудов в модель VMT представляет собой значительный прорыв, поскольку оно: 1) имитирует структуру и функции васкуляризированных опухолевых масс in vivo; 2) может моделировать ключевые этапы метастазирования, включая опухолево-эндотелиальные и стромальные клеточные взаимодействия; 3) устанавливает физиологически селективные барьеры для доставки питательных веществ и лекарственных средств, совершенствуя фармацевтический скрининг; и 4) позволяет проводить прямую оценку препаратов, обладающих антиангиогенными и антиметастатическими свойствами. Реплицируя доставку питательных веществ, лекарств и иммунных клеток in vivo в сложном 3D-микроокружении, платформа VMO/VMT является физиологически значимой моделью, которую можно использовать для проведения скрининга лекарств и изучения рака, сосудистой или органоспецифической биологии. Важно отметить, что VMT поддерживает рост различных типов опухолей, включая рак толстой кишки, меланому, рак молочной железы, глиобластому, рак легких, перитонеальный карциноматоз, рак яичников и рак поджелудочной железы 8,9,10,11,12,13. Помимо того, что микрофлюидная платформа является недорогой, легко устанавливаемой и пригодной для высокопроизводительных экспериментов, она полностью оптически совместима для анализа изображений в режиме реального времени взаимодействия опухоли и стромы и реакции на стимулы или терапевтические средства. Каждый тип клеток в системе помечен различными флуоресцентными маркерами, что позволяет напрямую визуализировать и отслеживать поведение клеток на протяжении всего эксперимента, создавая окно в динамическое микроокружение опухоли. Ранее мы показали, что VMT более точно моделирует in vivo рост опухоли, архитектуру, гетерогенность, сигнатуры экспрессии генов и реакцию на лекарственные препараты, чем стандартные методы культивирования10. Важно отметить, что VMT поддерживает рост и изучение клеток, полученных от пациентов, включая раковые клетки, что позволяет лучше моделировать патологию родительских опухолей, чем стандартные сфероидные культуры, и способствует дальнейшемуразвитию персонализированной медицины. В данной рукописи излагаются методы создания ВМТ, демонстрирующие ее полезность для изучения раковых опухолей человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Почти каждая ткань в организме получает питательные вещества и кислород через сосудистую сеть, что делает ее критически важным компонентом для реалистичного моделирования заболеваний и скрининга лекарств in vitro. Кроме того, некоторые злокачественные новообразования и болезненны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории доктора Кристофера Хьюза за их ценный вклад в описанные процедуры, а также наших сотрудников из лаборатории доктора Абрахама Ли за помощь в проектировании и изготовлении платформы. Эта работа была поддержана следующими грантами: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) и TL1 TR001415 и W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
