Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer
Summary
Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.
Abstract
La falta de modelos de cáncer validados que recapitulen el microambiente tumoral de los cánceres sólidos in vitro sigue siendo un obstáculo importante para la investigación preclínica del cáncer y el desarrollo terapéutico. Para superar este problema, hemos desarrollado el microtumor vascularizado (VMT), o chip tumoral, un sistema microfisiológico que modela de forma realista el complejo microambiente tumoral humano. El VMT se forma de novo dentro de una plataforma microfluídica mediante el cocultivo de múltiples tipos de células humanas en condiciones dinámicas de flujo fisiológico. Esta construcción microtumoral de ingeniería tisular incorpora una red vascular perfundida viva que soporta la creciente masa tumoral al igual que lo hacen los vasos recién formados in vivo. Es importante destacar que los fármacos y las células inmunitarias deben atravesar la capa endotelial para llegar al tumor, modelando in vivo las barreras fisiológicas para la administración y eficacia terapéuticas. Dado que la plataforma VMT es ópticamente transparente, se pueden lograr imágenes de alta resolución de procesos dinámicos como la extravasación de células inmunitarias y la metástasis con la visualización directa de células marcadas con fluorescencia dentro del tejido. Además, el VMT conserva la heterogeneidad tumoral in vivo , las firmas de expresión génica y las respuestas a fármacos. Prácticamente cualquier tipo de tumor se puede adaptar a la plataforma, y las células primarias de los tejidos quirúrgicos frescos crecen y responden al tratamiento farmacológico en el VMT, allanando el camino hacia una medicina verdaderamente personalizada. Aquí, se describen los métodos para establecer el VMT y utilizarlo para la investigación oncológica. Este enfoque innovador abre nuevas posibilidades para el estudio de los tumores y las respuestas a los fármacos, proporcionando a los investigadores una poderosa herramienta para avanzar en la investigación del cáncer.
Introduction
El cáncer sigue siendo un importante problema de salud en todo el mundo y es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Solo para el año 2023, el Centro Nacional de Estadísticas de Salud anticipa más de 1.9 millones de nuevos casos de cáncer y más de 600,000 muertes por cáncer en los EE. UU.1, lo que destaca la necesidad urgente de enfoques de tratamiento efectivos. Sin embargo, en la actualidad, solo el 5,1% de las terapias contra el cáncer que entran en ensayos clínicos finalmente obtienen la aprobación de la FDA. El fracaso de los candidatos prometedores para progresar con éxito a través de los ensayos clínicos puede atribuirse parcialmente al uso de sistemas modelo no fisiológicos, como cultivos 2D y esferoides, durante el desarrollo preclínico de fármacos2. Estos modelos clásicos de cáncer carecen de componentes esenciales del microambiente tumoral, como un nicho estromal, células inmunitarias asociadas y vasculatura perfundida, que son determinantes clave de la resistencia terapéutica y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es necesario un nuevo sistema modelo que imite mejor el microambiente tumoral humano in vivo para mejorar la traslación clínica de los hallazgos preclínicos.
El campo de la ingeniería de tejidos está avanzando rápidamente, proporcionando métodos mejorados para estudiar enfermedades humanas en entornos de laboratorio. Un desarrollo significativo es la aparición de los sistemas microfisiológicos (MPS), también conocidos como chips de órganos o chips de tejido, que son órganos humanos funcionales y miniaturizados capaces de replicar condiciones sanas o enfermas 3,4,5. En este contexto, se han desarrollado chips tumorales, que son modelos tumorales humanos in vitro tridimensionales basados en microfluídica, para la investigación oncológica 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estos modelos avanzados incorporan señales bioquímicas y biofísicas dentro de un microambiente tumoral dinámico, lo que permite a los investigadores estudiar el comportamiento tumoral y las respuestas a los tratamientos en un contexto fisiológicamente más relevante. Sin embargo, a pesar de estos avances, pocos grupos han incorporado con éxito una vasculatura viva y funcional, particularmente una que se automodela en respuesta al flujo fisiológico 3,4,5,6. La inclusión de una red vascular funcional es crucial, ya que permite modelar las barreras físicas que afectan a la administración de fármacos o células, la localización celular en distintos microambientes y la migración transendotelial de células tumorales, estromales e inmunitarias. Al incluir esta característica, el chip tumoral puede representar mejor las complejidades observadas en el microambiente tumoral in vivo.
Para hacer frente a esta necesidad insatisfecha, hemos desarrollado una novedosa plataforma de cribado de fármacos que permite la formación de redes de microvasos dentro de un dispositivo microfluídico 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Esta plataforma de chip de órgano base, denominada microórgano vascularizado (VMO), se puede adaptar a prácticamente cualquier sistema de órganos para replicar la fisiología del tejido original para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las aplicaciones de medicina personalizada. Las VMO se establecen mediante el cocultivo de células derivadas de células formadoras de colonias endoteliales (ECFC-EC), HUVEC o iPSC-EC (en adelante, EC) y múltiples células estromales en la cámara, incluidos los fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF), que remodelan la matriz, y los pericitos que envuelven y estabilizan los vasos. El VMO también se puede establecer como un sistema modelo de cáncer mediante el cocultivo de células tumorales con el estroma asociado para crear un modelo de microtumor vascularizado (VMT)8,9,10,11,12,13 o chip tumoral. A través del cocultivo de múltiples tipos celulares en un ambiente de flujo dinámico, las redes microvasculares perfundidas se forman de novo en las cámaras tisulares del dispositivo, donde la vasculogénesis está estrechamente regulada por las tasas de flujo intersticial14,15. El medio es conducido a través de los canales microfluídicos del dispositivo por un cabezal de presión hidrostática que suministra nutrientes a las células circundantes de la cámara tisular exclusivamente a través de los microvasos, con un coeficiente de permeabilidad de 1,2 x 10-7 cm/s, similar al observado para los capilares in vivo8.
La incorporación de microvasos autoorganizados en el modelo VMT representa un avance significativo porque: 1) imita la estructura y función de las masas tumorales vascularizadas in vivo; 2) puede modelar los pasos clave de la metástasis, incluidas las interacciones tumoral-endotelial y de células estromales; 3) establece barreras fisiológicamente selectivas para la administración de nutrientes y fármacos, mejorando el cribado farmacéutico; y 4) permite la evaluación directa de fármacos con capacidades antiangiogénicas y antimetastásicas. Al replicar la administración in vivo de nutrientes, fármacos y células inmunitarias en un complejo microentorno 3D, la plataforma VMO/VMT es un modelo fisiológicamente relevante que puede utilizarse para realizar el cribado de fármacos y estudiar la biología del cáncer, vascular o específica de órganos. Es importante destacar que el VMT apoya el crecimiento de varios tipos de tumores, incluidos el cáncer de colon, el melanoma, el cáncer de mama, el glioblastoma, el cáncer de pulmón, la carcinomatosis peritoneal, el cáncer de ovario y el cáncer de páncreas 8,9,10,11,12,13. Además de ser de bajo costo, fácil de establecer y estar preparada para experimentos de alto rendimiento, la plataforma microfluídica es totalmente compatible ópticamente para el análisis de imágenes en tiempo real de las interacciones tumor-estroma y la respuesta a estímulos o terapias. Cada tipo de célula en el sistema está marcada con un marcador fluorescente diferente para permitir la visualización directa y el seguimiento del comportamiento celular a lo largo de todo el experimento, creando una ventana al microambiente tumoral dinámico. Hemos demostrado previamente que el VMT modela más fielmente el crecimiento tumoral in vivo, la arquitectura, la heterogeneidad, las firmas de expresión génica y las respuestas a los fármacos que las modalidades de cultivo estándar10. Es importante destacar que el VMT apoya el crecimiento y el estudio de las células derivadas de los pacientes, incluidas las células cancerosas, lo que modela mejor la patología de los tumores progenitores que los cultivos esferoides estándar y avanza aún más en los esfuerzos de la medicina personalizada11. Este manuscrito describe los métodos para establecer el VMT, mostrando su utilidad para el estudio de los cánceres humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Casi todos los tejidos del cuerpo reciben nutrientes y oxígeno a través de la vasculatura, lo que la convierte en un componente crítico para el modelado realista de enfermedades y la detección de fármacos in vitro. Además, varias neoplasias malignas y estados patológicos se definen por la disfunción endotelial vascular y la hiperpermeabilidad3. En particular, en el cáncer, la vasculatura asociada al tumor a menudo está mal perfundida, interrumpida y permeable, lo que actúa como…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio del Dr. Christopher Hughes por su valiosa contribución a los procedimientos descritos, así como a nuestros colaboradores en el laboratorio del Dr. Abraham Lee por su ayuda con el diseño y la fabricación de la plataforma. Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes subvenciones: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) y TL1 TR001415 y W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
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