Mechanische Dissoziation von Geweben für die Einzelzellanalyse mit einem motorisierten Gerät
Summary
Es wird ein allgemeines Protokoll für die kombinierte enzymatische und halbautomatische mechanische Dissoziation von Geweben zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, bereitgestellt. Anweisungen für die Herstellung, Montage und den Betrieb der kostengünstigen mechanischen Vorrichtung, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, sind enthalten.
Abstract
Die Möglichkeit, einzelne Zellen für die Analyse von Gewebeproben zu isolieren und vorzubereiten, ist für neue biomedizinische Entdeckungen und Forschungen schnell entscheidend geworden. Manuelle Protokolle für Einzelzellisolierungen sind sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzervariabilität. Automatisierte mechanische Protokolle sind in der Lage, die Verarbeitungszeit und die Probenvariabilität zu reduzieren, sind aber in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen nicht leicht zugänglich oder kostengünstig. Das hier beschriebene Gerät wurde für die halbautomatische Gewebedissoziation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien als kostengünstige Alternative für akademische Labore entwickelt. Anweisungen zur Herstellung, Montage und Bedienung des Gerätedesigns wurden bereitgestellt. Das Dissoziationsprotokoll erzeugt zuverlässig Einzelzellsuspensionen mit vergleichbaren Zellausbeuten und Probenviabilität wie manuelle Präparationen über mehrere Mausgewebe. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebeproben gleichzeitig pro Gerät zu verarbeiten, wodurch Studien, die große Probengrößen erfordern, leichter zu bewältigen sind. Die mitgelieferte Software ermöglicht auch die Anpassung des Geräteprotokolls, um unterschiedliche Gewebe und experimentelle Einschränkungen zu berücksichtigen.
Introduction
Die Einzelzellanalyse ist für neue biomedizinische Entdeckungen schnell von entscheidender Bedeutung geworden, sei es für Anwendungen wie die Durchflusszytometrie, die Identifizierung verschiedener Zelltypen, die Einzelzellsequenzierung oder die Identifizierung genomischer oder transkriptomischer Variationen zwischen Zellen1. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert das Zerkleinern von präpariertem Gewebe und das Schieben durch ein feines Zellsieb, um das Bindegewebe aus den gewünschten Zellen herauszufiltern (Abbildung 1A). Die Isolierung adhärenter Zelltypen, wie dendritische Zellen oder Makrophagen, oder Zellen aus besonders faserigen Geweben erfordert zusätzliche mechanische oder enzymatische Trennschritte 2,3,4. Dieser Prozess wird in der Regel manuell durchgeführt, was ihn sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzerschwankungen bei der Beurteilung von Zellausbeuten und Probenviabilität macht. Daher ist es wichtig, anpassbare Optionen für die automatisierte Gewebedissoziation einzuführen. Es wurden zwar einige Versuche unternommen, solche Systeme zu entwickeln, aber die vorhandenen Optionen sind nicht immer leicht zugänglich, insbesondere in akademischen Labors und ressourcenärmeren Umgebungen, was vor allem auf die unerschwingliche Natur dieser Geräte zurückzuführenist 5. Darüber hinaus sind diese Geräte nicht immer an die individuellen Bedürfnisse einer Forschungsgruppe anpassbar6.
Hier wurde ein Gewebedissoziatorgerät entwickelt, um den Verdau ganzer Gewebe oder Gewebestücke in Einzelzellsuspensionen mit Hilfe von Verdauungsenzymen und mechanischem Aufschluss zu automatisieren. Dieses Gerät kann einfach im Labor zusammengebaut, zur Temperaturregulierung in Heiz- oder Kühlkammern platziert, an die erforderliche Anzahl von zu dissoziierenden Geweben angepasst und mit den gewünschten Dissoziationsprotokollen programmiert werden. Der breite Einsatz dieses Geräts könnte die Reproduzierbarkeit von Zellextraktionsprotokollen erheblich verbessern und eine zeitsparende Alternative zur manuellen Dissoziation bieten.
Das Design ermöglicht den gleichzeitigen Aufschluss von bis zu 12 Geweben durch einen automatisierten Prozess. Das Gerät besteht aus 12 einzelnen Motoren, die parallel geschaltet sind und über einen Standard-Wandstecker über einen AC/DC-Adapter mit einstellbarem Spannungsregler zur Steuerung der Rotation/Drehzahl der Motoren mit Strom versorgt werden. Die Motoren drehen eine Sechskantschraube, die genau in die Oberseite der C-Rohre passt. Die C-Rohre werden durch Abwärtsspannung auf einer Acrylplatte gehalten, die auf beiden Seiten an der oberen Platte einrastet, an der die Motoren befestigt sind (Abbildung 1B). Da die Motoren parallel verdrahtet sind, sollte ihre Drehzahl bei einer bestimmten Spannung nicht stark variieren, aber die Last (die Anzahl der am Gerät montierten C-Röhren) beeinflusst die Drehzahl, selbst wenn die Spannung konstant gehalten wird. Zur Messung der Umdrehungen pro Minute (U/min) wurde ein Drehzahlmesser mit einem Hall-Effekt-Sensor und einem festen Magneten auf einer der Motorwellen eingebaut (Ergänzende Abbildung 1). Die CAD-Dateien für den Bau von Motor-Arrays werden in der ergänzenden Codierungsdatei 1 bereitgestellt. Ebenfalls enthalten ist ein programmierbarer Schalter zur Umkehrung der Drehrichtung durch Umkehrung der an die Motoren abgegebenen positiven/negativen Ladungen. Alle diese Funktionen werden mithilfe einer codierten Software (Arduino IDE-Software, siehe Materialtabelle) auf einem Arduino Nano (Supplementary Coding File 2) integriert. Mit angeschlossenen Tasten und einem LCD-Panel (Ergänzende Abbildung 2) ist es möglich, gespeicherte und benutzerdefinierte Protokolle zu erstellen und auszuführen, die Drehrichtung zu bestimmten Zeiten eines Protokolls automatisch umzukehren, die Drehzahl anhand der Spannung anzupassen (Ergänzende Abbildung 3) und die aktuelle Motordrehzahl und die verbleibende Zeit anzuzeigen, um ein programmiertes Protokoll abzuschließen (Ergänzende Abbildung 4).
Für die vorliegende Studie wurden Einzelzellsuspensionen sowohl unter Verwendung mechanisch-enzymatischer Gewebedissoziation mit diesem Gerät als auch manuell-enzymatischer Gewebedissoziation hergestellt, um gegebenenfalls Unterschiede in Zellen zu bestimmen, die für nachgeschaltete Anwendungen gewonnen wurden. Die Zellpräparate wurden auf der Grundlage der Gesamtzellausbeute pro Gewebe und der prozentualen Zellviabilität bewertet. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um potenzielle Unterschiede in der Oberflächenmarkerexpression zu vergleichen. Die Daten wurden mit Hilfe von Grafik- und statistischer Analysesoftware analysiert. Unpaarige Welch-t-Tests wurden verwendet, um Paare von Proben oder Gruppen zu vergleichen, wobei die Stichprobengrößen n > 4 Mäusen 2 Wiederholungsexperimente darstellten. Detaillierte Anweisungen zur Herstellung und Montage dieses Geräts finden Sie in der Zusatzdatei 1. Die für dieses Protokoll benötigten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Gerät wurde für die einfache Montage in der Forschungsumgebung entwickelt, um Einzelzellsuspensionen aus ganzen Geweben für die anschließende Einzelzellanalyse bereitzustellen. Die Funktionen sind zwar einfach, reichen aber aus, um die Bedürfnisse von Forschern im akademischen Umfeld und darüber hinaus zu erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Geräts ist sein Potenzial, die Herstellung von Einzelzellsuspensionen durch Verringerung der Variabilität zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Fähigkeit, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung erfolgte durch das Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), das Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), die LAM Foundation (KM) und die American Lung Association (KM). Die Autoren danken Michele Kaluzienski für die Hilfe bei der Bearbeitung.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
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