電動装置を用いた単一細胞解析のための組織の機械的解離
Summary
フローサイトメトリーなどのダウンストリーム解析用の単一細胞懸濁液を生成するために、組織の酵素的および半自動機械的解離を組み合わせるための一般的なプロトコルが提供されています。このプロトコル用に開発された低コストの機械装置の製造、組み立て、および操作に関する説明が含まれています。
Abstract
組織サンプルの分析のために単一細胞を単離して調製できることは、新しい生物医学的発見や研究にとって急速に重要になっています。シングルセル単離のための手動プロトコルは、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすいです。自動化された機械的プロトコルは、処理時間とサンプルのばらつきを減らすことができますが、リソースの少ない研究環境では簡単にアクセスできず、費用対効果も高くありません。ここで説明する装置は、学術研究室向けの低コストの代替品として市販の材料を使用した半自動組織解離用に設計されました。デバイス設計を製造、組み立て、および操作するための手順が提供されています。解離プロトコルは、複数のマウス組織にわたる手動調製と同等の細胞収量とサンプル生存率を持つ単一細胞懸濁液を確実に生成します。このプロトコルは、デバイスごとに最大12個の組織サンプルを同時に処理する機能を提供し、大きなサンプルサイズを必要とする研究をより管理しやすくします。付属のソフトウェアにより、さまざまな組織や実験の制約に対応するためにデバイスプロトコルをカスタマイズすることもできます。
Introduction
シングルセル解析は、フローサイトメトリー、異なる細胞タイプの同定、シングルセルシーケンシング、細胞間のゲノムやトランスクリプトーム変異の同定などのアプリケーションにおいて、新しい生物医学的発見に急速に重要になっています1。目的組織からこのような細胞単離を行うには、解剖した組織を細かく刻み、それらを微細なセルストレーナーに押し込んで、目的の細胞から結合組織をろ過する必要があります(図1A)。樹状細胞やマクロファージなどの接着細胞タイプ、または特に線維組織からの細胞を単離するには、追加の機械的または酵素的分離ステップが必要です2,3,4。このプロセスは通常、手作業で行われるため、細胞収量やサンプルの生存率を評価する際に、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすくなります。したがって、自動組織解離のためのカスタマイズ可能なオプションを導入することが重要です。このようなシステムを設計する試みはいくつか行われてきましたが、特に学術研究室やリソースの少ない環境では、主にこれらのデバイスのコストが法外な性質のために、既存のオプションに常に容易にアクセスできるとは限りません5。さらに、これらの機器は、研究グループ6の個々のニーズに合わせて常にカスタマイズできるとは限らない。
ここでは、消化酵素と機械的破壊の助けを借りて、組織全体または組織片の単一細胞懸濁液への消化を自動化するように組織解離装置が設計されました。この装置は、実験室で簡単に組み立てることができ、温度調節のために加熱室または冷却室に入れ、解離に必要な組織数に合わせてカスタマイズし、目的の解離プロトコルでプログラムすることができます。このデバイスを広く使用することで、細胞抽出プロトコルの再現性が大幅に向上し、手動解離に代わる時間節約が期待できます。
この設計により、自動化されたプロセスにより、最大12個の組織を同時に消化することができます。このデバイスは、並列に配線された12個の個別のモーターで構成され、モーターの回転/速度を制御するための調整可能な電圧ダイヤルを備えたAC/DCアダプターを介して標準の壁プラグから電力を供給されます。モーターは、Cチューブの上部にぴったりと収まる六角ボルトを回転させます。Cチューブは、モーターが固定されているトッププレートの両側にラッチするアクリルプレートに下向きの張力をかけることで所定の位置に保持されます(図1B)。モーターは並列に配線されているため、任意の電圧での速度はあまり変化しませんが、電圧が一定に保たれていても、負荷(デバイスに取り付けられたCチューブの数)が速度に影響を与えます。毎分回転数(rpm)を測定するために、ホール効果センサーとモーターシャフトの1つに固定磁石を使用してタコメーターが組み込まれています(補足図1)。モーターアレイを構築するためのCADファイルは、 補足コーディングファイル1で提供されています。また、モーターに供給される正/負の電荷を逆転させることで回転方向を反転させるプログラム可能なスイッチも含まれています。これらの機能はすべて、コード化されたソフトウェア(Arduino IDEソフトウェア、 材料表を参照)を使用して、Arduino Nano(補足コーディングファイル2)に統合されています。接続されたボタンとLCDパネル(補足図2)を使用して、保存されたプロトコルとカスタムプロトコルを作成および実行し、プロトコルの指定された時間に回転方向を自動的に反転させ、電圧を使用して速度を調整し(補足図3)、プログラムされたプロトコルを完了するための現在のモーター速度と残り時間を表示することができます(補足図4)。
本研究では、このデバイスによる機械的酵素的組織解離と手動酵素組織解離の両方を使用して単一細胞懸濁液を調製し、下流のアプリケーション用に回収された細胞に違いがある場合、その違いを決定しました。細胞調製物は、組織あたりの総細胞収量および細胞生存率に基づいて評価しました。フローサイトメトリーを使用して、表面マーカー発現の潜在的な違いを比較しました。データは、グラフ作成および統計解析ソフトウェアを使用して分析しました。対応のないウェルチの t検定 は、2つの反復実験を表す4匹のマウス>サンプルサイズnで、サンプルまたはグループのペアを比較するために使用されました。このデバイスの製造と組み立ての詳細な手順は、 補足ファイル1に記載されています。このプロトコルに必要な材料は、 材料表に記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このデバイスは、研究環境で簡単に組み立てられるように設計されており、その後のシングルセル解析のために組織全体からシングルセル懸濁液を提供します。これらの機能は、基本的なものですが、学術現場やその他の研究者のニーズを満たすのに十分です。このデバイスを使用する主な利点は、ばらつきを低減することにより、単一細胞懸濁液の調製を改善できる可能性があることです?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金提供は、Fischell Department of Bioengineering(KM)、T32 GM080201(MA)、Vogel Endowed Summer Fellowship(MA)、LAM Foundation(KM)、およびAmerican Lung Association(KM)から受けました。著者は、編集を手伝ってくれたMichele Kaluzienskiに感謝します。
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
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