Mekanisk dissosiasjon av vev for enkeltcelleanalyse ved hjelp av en motorisert enhet
Summary
En generell protokoll for kombinert enzymatisk og semi-automatisert mekanisk dissosiasjon av vev for å generere encellede suspensjoner for nedstrømsanalyser, slik som flowcytometri, er gitt. Instruksjoner for fabrikasjon, montering og drift av den rimelige mekaniske enheten utviklet for denne protokollen er inkludert.
Abstract
Å kunne isolere og forberede enkeltceller for analyse av vevsprøver har raskt blitt avgjørende for nye biomedisinske funn og forskning. Manuelle protokoller for enkeltcelleisolasjoner er svært tidkrevende og utsatt for brukervariasjon. Automatiserte mekaniske protokoller er i stand til å redusere behandlingstid og utvalgsvariabilitet, men er ikke lett tilgjengelige eller kostnadseffektive i forskningsinnstillinger med lavere ressurser. Enheten beskrevet her ble designet for semi-automatisert vevsdissosiasjon ved bruk av kommersielt tilgjengelige materialer som et billig alternativ for akademiske laboratorier. Instruksjoner for å fremstille, montere og betjene enhetens design er gitt. Dissosiasjonsprotokollen produserer pålitelig enkeltcellesuspensjoner med sammenlignbare celleutbytter og prøvens levedyktighet til manuelle preparater over flere musevev. Protokollen gir muligheten til å behandle opptil 12 vevsprøver samtidig per enhet, noe som gjør studier som krever store prøvestørrelser mer håndterbare. Den medfølgende programvaren tillater også tilpasning av enhetsprotokollen for å imøtekomme varierende vev og eksperimentelle begrensninger.
Introduction
Enkeltcelleanalyse har raskt blitt avgjørende for nye biomedisinske oppdagelser, enten for applikasjoner som flowcytometri, identifisering av forskjellige celletyper, enkeltcellesekvensering eller for å identifisere genomiske eller transkriptomiske variasjoner mellom celler1. Å utføre slike celleisoleringer fra vev av interesse krever hakking av dissekerte vev og skyve dem gjennom en fin cellesil for å filtrere ut bindevev fra de ønskede cellene (figur 1A). Isolering av adherente celletyper, som dendrittiske celler eller makrofager, eller celler fra spesielt fibrøst vev, krever ytterligere mekaniske eller enzymatiske separasjonstrinn 2,3,4. Denne prosessen gjøres vanligvis manuelt, noe som gjør den svært tidkrevende og utsatt for brukervariabilitet når man vurderer celleutbytter og prøvens levedyktighet. Derfor er det avgjørende å introdusere tilpassbare alternativer for automatisert vevsdissosiasjon. Mens noen forsøk har blitt gjort for å designe slike systemer, er de eksisterende alternativene ikke alltid lett tilgjengelige, spesielt i akademiske laboratorier og lavere ressursinnstillinger, hovedsakelig på grunn av den kostnadsuoverkommelige naturen til disse enhetene5. Videre kan disse enhetene ikke alltid tilpasses de individuelle behovene til en forskningsgruppe6.
Her ble en vevsdissosiatorenhet designet for å automatisere fordøyelsen av hele vev eller vevstykker til encellede suspensjoner ved hjelp av fordøyelsesenzymer og mekanisk forstyrrelse. Denne enheten kan enkelt monteres i laboratoriet, plasseres i varme- eller kjølekamre for temperaturregulering, tilpasset det nødvendige antall vev for å dissociere, og programmeres med de ønskede dissosiasjonsprotokollene. Den brede bruken av denne enheten kan forbedre reproduserbarheten av celleekstraksjonsprotokoller betydelig og gi et tidsbesparende alternativ til manuell dissosiasjon.
Designet muliggjør samtidig fordøyelse av opptil 12 vev gjennom en automatisert prosess. Enheten består av 12 individuelle motorer koblet parallelt og drevet av en standard veggplugg gjennom en AC / DC-adapter med et justerbart spenningshjul for å kontrollere motorens rotasjon / hastighet. Motorene snur en sekskantbolt som passer godt inn i toppen av C-rørene. C-rørene holdes på plass av nedadgående spenning på en akrylplate som låses på hver side til topplaten der motorene er festet (figur 1B). Fordi motorene er koblet parallelt, bør hastigheten ved en gitt spenning ikke variere mye, men belastningen (antall C-rør montert på enheten) vil påvirke hastigheten selv når spenningen holdes konstant. For å måle rotasjoner per minutt (rpm) er det integrert en turteller ved hjelp av en halleffektsensor og en fast magnet på en av motorakslene (tilleggsfigur 1). CAD-filene for bygging av motormatriser finnes i tilleggskodefil 1. Inkludert er også en programmerbar bryter for å reversere rotasjonsretningen ved å reversere de positive / negative ladningene som leveres til motorene. Alle disse funksjonene er integrert ved hjelp av kodet programvare (Arduino IDE-programvare, se Materialfortegnelse) på en Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Ved hjelp av tilkoblede knapper og et LCD-panel (tilleggsfigur 2) er det mulig å opprette og kjøre lagrede og egendefinerte protokoller, automatisk reversere rotasjonsretningen på bestemte tidspunkter i en protokoll, justere hastigheten ved hjelp av spenningen (tilleggsfigur 3) og vise gjeldende motorhastighet og tid som gjenstår for å fullføre en programmert protokoll (tilleggsfigur 4).
For denne studien ble enkeltcellesuspensjoner fremstilt ved bruk av både mekanisk-enzymatisk vevsdissosiasjon med denne enheten og manuell-enzymatisk vevsdissosiasjon for å bestemme forskjeller, om noen, i celler gjenvunnet for nedstrøms applikasjoner. Cellepreparatene ble evaluert basert på totalt celleutbytte per vev og prosent cellelevedyktighet. Flowcytometri ble brukt for å sammenligne potensielle forskjeller i overflatemarkøruttrykk. Data ble analysert ved hjelp av grafisk og statistisk analyseprogramvare. Uparede Welch t-tester ble brukt til å sammenligne par av prøver eller grupper, med utvalgsstørrelser n > 4 mus som representerer 2 replikere eksperimenter. Detaljerte instruksjoner for fabrikasjon og montering av denne enheten finnes i tilleggsfil 1. Materialer som trengs for denne protokollen er oppført i materialfortegnelsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne enheten ble designet for enkel montering i forskningsinnstillingen for å gi enkeltcellesuspensjoner fra hele vev for påfølgende enkeltcelleanalyse. Funksjonene, selv om de er grunnleggende, er tilstrekkelige til å møte behovene til forskere i akademiske omgivelser og utover. En viktig fordel ved å bruke denne enheten er dens potensial til å forbedre fremstillingen av encellede suspensjoner ved å redusere variabiliteten. I tillegg kan muligheten til å behandle 12+ prøver samtidig forbedre prøve-til-prøve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering ble mottatt fra Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) og American Lung Association (KM). Forfatterne takker Michele Kaluzienski for hjelp med redigering.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
References
- Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).
- Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Rittié, L. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).
- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).
- McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
- Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).
- Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
- Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
- Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
- Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333 (2020).
