En protokol præsenteres for at evaluere, om små EV’er (sEV’er) isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold (modellering af et aspekt af præeklampsi) forstyrrer blod-hjernebarrieren hos ikke-gravide voksne hunmus.
Cerebrovaskulære komplikationer, herunder cerebralt ødem og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde, udgør den førende årsag til moderdødelighed forbundet med præeklampsi. De underliggende mekanismer bag disse cerebrovaskulære komplikationer forbliver uklare. Men, de er forbundet med placenta dysfunktion og blod – hjerne barriere (BBB) forstyrrelse. Ikke desto mindre er forbindelsen mellem disse to fjerne organer stadig ved at blive bestemt. Stigende beviser tyder på, at moderkagen frigiver signalmolekyler, herunder ekstracellulære vesikler, i moderens cirkulation. Ekstracellulære vesikler er kategoriseret efter deres størrelse, med små ekstracellulære vesikler (sEV’er mindre end 200 nm i diameter) betragtes som kritiske signalpartikler under både fysiologiske og patologiske tilstande. I præeklampsi er der et øget antal cirkulerende sEV’er i moderens cirkulation, hvis signalfunktion ikke forstås godt. Placenta-sEV’er frigivet i præeklampsi eller fra normale graviditetsplacentas udsat for hypoxi inducerer hjerneendoteldysfunktion og forstyrrelse af BBB. I denne protokol vurderer vi, om sEV’er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold (modellering af et aspekt af præeklampsi) forstyrrer BBB in vivo.
Ca. 70% af moderens dødsfald på grund af præeklampsi, et hypertensive graviditetssyndrom præget af nedsatte placentationsprocesser, maternel systemisk endoteldysfunktion og i alvorlige tilfælde multiorgansvigt 1,2 er forbundet med akutte cerebrovaskulære komplikationer 3,4. De fleste mødredødsfald forekommer i lav- og mellemindkomstlande5. Imidlertid er de underliggende mekanismer stadig uklare på trods af den kliniske og epidemiologiske relevans af cerebrovaskulære komplikationer forbundet med præeklampsi.
På den anden side er ekstracellulære vesikler (EV’er) (diameter ~ 30-400 nm) essentielle mediatorer af intercellulær kommunikation mellem væv og organer, herunder maternal-placenta interaktion6. Ud over proteiner og lipider på den ydre overflade transporterer EV’er last indeni (proteiner, RNA og lipider). EV’er kan kategoriseres i (1) exosomer (diameter ~ 50-150 nm, også kaldet små EV’er (sEV’er)), (2) mellemstore / store EV’er og (3) apoptotiske legemer, som adskiller sig efter størrelse, biogenese, indhold og potentiel signalfunktion. EV’ernes sammensætning bestemmes af de celler, de stammer fra, og sygdomstype7. Syncytiotrophoblastafledte EV’er udtrykker placenta alkalisk fosfatase (PLAP)8,9, som detekterer placentae-afledte cirkulerende små EV’er (PDsEV’er) under graviditet. PLAP hjælper også med at skelne ændringer i PDsEVs last og deres virkninger i præeklampsi versus normotensive graviditeter 10,11,12,13,14,15.
Placenta er blevet anerkendt som den nødvendige komponent i patofysiologien af præeklampsi16 eller cerebrale komplikationer forbundet med denne sygdom 17,18,19. Men hvordan dette fjerne organ kan fremkalde ændringer i hjernens cirkulation er ukendt. Da sEV’er spiller afgørende roller i celle-til-celle-kommunikation på grund af deres evne til at overføre bioaktive komponenter fra donor- til modtagerceller 6,20,21, har et stigende antal undersøgelser forbundet placenta sEV’er med generering af maternal endoteldysfunktion21,22,23,24, herunder hjerneendotelceller25,26hos kvinder med præeklampsi. Således kan kompromiset med hjernens endotelfunktion føre til forstyrrelse af blod-hjerne-barrieren (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulære komplikationer forbundet med præeklampsi 3,27.
Ikke desto mindre rapporterede prækliniske fund ved hjælp af rottecerebrale kar udsat for serum hos kvinder med præeklampsi28 eller humane hjerneendotelceller udsat for plasma hos kvinder med præeklampsi29, at cirkulerende faktor (er) inducerer forstyrrelse af BBB. På trods af flere kandidater med potentiale til at skade BBB til stede i moderens cirkulation under præeklampsi, såsom forhøjede niveauer af proinflammatoriske cytokiner (dvs. tumornekrosefaktor)18,28 eller vaskulære regulatorer (dvs. vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF))29,30,31 eller oxidative molekyler såsom oxiderede lipoproteiner (oxo-LDL)32,33, blandt andre34, ingen af dem etablerer en direkte forbindelse mellem moderkagen og BBB. For nylig har sEV’er isoleret fra hypoxiske placentas vist evnen til at forstyrre BBB hos ikke-gravide hunmus25. Da placenta sEV’er kan bære de fleste af de anførte cirkulerende faktorer med kapacitet til at forstyrre BBB, betragtes sEV’er som egnede kandidater til at forbinde den skadede placenta, være bærer af skadelige cirkulerende faktorer og forstyrre BBB i præeklampsi.
Denne protokol giver os mulighed for at undersøge, om sEV’er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold kan forstyrre BBB hos ikke-gravide hunmus som en proxy for forståelse af patofysiologien af cerebrale komplikationer under præeklampsi.
Denne undersøgelse afslører frisk indsigt i potentiel skade som følge af sEV’er isoleret fra placentaeksplanter dyrket under hypoxiske forhold om forstyrrelsen af gnaverblod-hjernebarrieren. Den patologiske mekanisme indebærer en reduktion i CLND-5 i den bageste hjerneregion25.
Tidligere undersøgelser har vist, at plasma-sEV’er fra personer med præeklampsi inducerer endoteldysfunktion i forskellige organer ved hjælp af in vitro-modeller <sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke forskerne i GRIVAS Health for deres værdifulde input. Også jordemødre og klinisk personale fra obstetrik og gynækologi service tilhører Hospital de Chillan, Chile. Grundlagt af Fondecyt Regular 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |