يتم تقديم بروتوكول لتقييم ما إذا كانت EVs الصغيرة (sEVs) المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل الحاجز الدموي الدماغي في إناث الفئران البالغة غير الحوامل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتشكل المضاعفات الدماغية الوعائية، بما في ذلك الوذمة الدماغية والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية، السبب الرئيسي لوفيات الأمهات المرتبطة بمقدمات الارتعاج. الآليات الكامنة وراء هذه المضاعفات الدماغية الوعائية لا تزال غير واضحة. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بخلل المشيمة واضطراب حاجز الدم في الدماغ (BBB). ومع ذلك ، لا يزال يتم تحديد العلاقة بين هذين الجهازين البعيدين. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المشيمة تطلق جزيئات الإشارة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية ، في الدورة الدموية للأم. يتم تصنيف الحويصلات خارج الخلية وفقا لحجمها ، مع الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs أصغر من 200 نانومتر في القطر) تعتبر جزيئات إشارات حرجة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في تسمم الحمل ، هناك عدد متزايد من sEVs المتداولة في الدورة الدموية للأمهات ، والتي لا يتم فهم وظيفة الإشارة إليها جيدا. تحفز التشوهات المشيمية التي يتم إطلاقها في مقدمات الارتعاج أو من مشيمة الحمل الطبيعية المعرضة لنقص الأكسجة الخلل البطاني في الدماغ وتعطيل BBB. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم ما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل BBB في الجسم الحي.
المقدمة
ما يقرب من 70 ٪ من وفيات الأمهات بسبب تسمم الحمل ، ومتلازمة الحمل ارتفاع ضغط الدم التي تتميز بضعف عمليات المشيمة ، والخلل البطاني الجهازي للأم ، وفي الحالات الشديدة ، الفشل متعدد الأعضاء1،2 ، ترتبط بمضاعفات الأوعية الدموية الدماغية الحادة 3,4. تحدث معظم وفيات الأمهات في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل5. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة على الرغم من الأهمية السريرية والوبائية للمضاعفات الدماغية الوعائية المرتبطة بتسمم الحمل.
من ناحية أخرى ، تعد الحويصلات خارج الخلية (EVs) (القطر ~ 30-400 ن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء البحث وفقا للمبادئ المعبر عنها في إعلان هلسنكي وبإذن من مجالس المراجعة الأخلاقية المعنية. أعطى جميع المشاركين من البشر موافقتهم المستنيرة قبل جمع العينات ، كما ورد سابقا25. وبالإضافة إلى ذلك، وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا والسلامة البيولوجية التابعة لجامعة بيو - بيو على هذا المشروع (منحة Fondecyt 1200250). تم إجراء العمل الحيواني وفقا للمبادئ الأساسية للثلاثة R في استخدام في التجربة35 ، ووفقا لتوصيات المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر التي نشرها المعهد الوطني الأمريكي للصحة. تم الاحتفاظ بالحيوانات في بيئات مناسبة في بيت بجامعة بيو بيو. تم الحصول على المشيمة الطازجة (ن = 4) في غضون 1 ساعة بعد العملية القي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يقيم هذا البروتوكول قدرة sEVs المشتقة من المشيمة المزروعة في نقص الأكسجة على تعطيل BBB في الفئران غير الحوامل. تسمح هذه الطريقة للمرء بفهم أفضل للعلاقة المحتملة بين المشيمة والدماغ في الظروف الطبيعية والمرضية. على وجه الخصوص ، قد تشكل هذه الطريقة وكيلا لتحليل مشاركة sEVs المشيمة في بداية المضاعفات الدماغية في تسمم الحمل.
على عكس الفئران المحقونة ب sEVs-Nor ، تظهر الفئران المحقونة ب sEVs-Hyp انخفاضا تدريجيا في النتيجة العصبية حتى 24 ساعة (الجدول 1) ، مما يشير إلى قدرة sEVs-Hyp .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تكشف هذه الدراسة النقاب عن رؤى جديدة حول الضرر المحتمل الناتج عن sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظروف نقص الأكسجين على اضطراب حاجز الدم في دماغ القوارض. تتضمن الآلية المرضية انخفاضا في CLND-5 في منطقة الدماغ الخلفية25.
كشفت التحقيقات السابقة أن البلازما sEVs من الأفراد المصابين بتسمم الحمل تحفز الخلل البطاني في مختلف الأعضاء باستخدام النماذج في المختبر 46,47. قام هذا التحقيق بشكل خاص بفحص ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا الباحثين الذين ينتمون إلى GRIVAS Health على مدخلاتهم القيمة. كما تنتمي القابلات والموظفون السريريون من خدمة أمراض النساء والتوليد إلى مستشفى دي شيلان ، تشيلي. أسسها فونديسيت العادية 1200250.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفئران البالغة الدماغ slecer ماتريكوس 3D مطبوعة | ملف الوصول المفتوح | الفئران البالغة الفئران | البالغة تقطيع الدماغ. مطبوع في خيوط جيش التحرير الشعبى الصينى. |
| الأجسام المضادة الأولية المضادة للأكتين | سيجما-ألدريتش | كلون AC-74 | للتحكم في التحميل (اللطخة الغربية) |
| الجسم المضاد الأساسي المضاد | للكلاودين 5 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-374221 | الجسم المضاد الأساسي لبروتين الوصلة الضيقة CLDN5 للفئران BBB (اللطخة الغربية) |
| مجموعة بروتين BCA | مجموعة Thermo Scientific | 23225 | لقياس تركيز البروتين |
| وسائط الثقافة # 200 500 مل | Thermo Fisher Scientific | m200500 | وسائط الثقافة لعمليات المشيمة |
| D180 CO2< / sub> حاضنة | RWD Life science | D180 | حاضنة قياسية لتثبيت النباتات المستخرجة والثقافة sEVs-Nor |
| Evans Blue صبغة > 75٪ 10 جم | Sigma-Aldrich | E2129.10G | صبغة لتحليل اضطراب الحاجز الدموي الدماغي في الجسم الحي |
| مصل بقري الجنين 500 مل | حراري فيشر 16000044 العلمي | عامل النمو المضاف لوسائط الاستزراع 200 | |
| طرد مركزي فائق Himac CP100NX | Himac eppendorf | 5720410101 | أجهزة الطرد المركزي الفائقة للوسائط المعدة > 1،20،000 × |
| جم برنامج ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane × 100 مل | USP Baxter | 212-094 | عامل تخدير مستنشق متطاير للفئران |
| كيت سيلتيتر 96 غير مشع | Promega | 0000105232 | في المختبر < / em> فحص لاستخلاص المشيمة الجدوى |
| الماوس IgG الجسم المضاد الثانوي | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | الجسم المضاد الثانوي ل CLDN5 (اللطخة الغربية) |
| NanoSight NS300 | Malvern | Panalytical 90278090 | تحليل التتبع النانوي للجسيمات من المكثفات المشيمية الوسائط المرفقة |
| Paraformaldehide E 97٪ محلول 500 مل | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | محلول مثبت لشرائح أنسجة المخ والتروية داخل القلب (مرة واحدة مخففة) |
| PBS 1 × درجة الحموضة 7.4 500 مل | محلول غسيل 10010023 Thermo Fisher Scientific | لمستخرجات المشيمة | |
| Peniciline-Streptomicine 100x 20 مل | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | مضادات الأحياء لوسائط |
| زراعة مستخلصات المشيمةProOX C21 مركزية الخلايا O2< / sub> و CO2< / sub> وحدة تحكم الغرفة الفرعية | BioSpherix | SCR_021131 | CO2< / sub> للحث على نقص الأكسجة في غرفة محكمة الغلق ل sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | عامل القتل الرحيم |
| الإنساني Somnosuite نظام التخدير منخفض التدفق | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane المرذاذ للقوارض الصغيرة |
| منصة الاحترار الجراحية | Kent Scientifics | A41166 | منصة الاحترار لتخدير الصيانة في الفئران |
| مرشحات الحقن ، Polytetrafluoroethylene (PTFE) ، كارهة للماء ، 0.22 وميكرو ؛ م ، معقمة ، 25 مم | مختبرات جنوبية | 10026 | ترشيح الوسائط المضطربة التي يتم حصادها من النباتات المشيمية ؛ |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عالية السرعة المنضدية هيتاشي هيماك CT15E / CT15RE | هيتاشي أنظمة طبية | 6020 | أجهزة الطرد المركزي التسلسلية للوسائط المجهزة < 1،20 ، 000 × جم |
| مجهر مجهر ثلاثي العينيات معبر وضوء عاكس 10x-160x & nbsp ؛ | سنتر ميديكال | 2597 | مجهر مجسم لتسجيل شرائح الدماغ |
المراجع
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (200....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
