Her præsenterer vi et omfattende adfærdstestbatteri, herunder den nye tank, Shoaling og sociale præferencetest, for effektivt at bestemme de potentielle neurotoksiske virkninger af kemikalier (f.eks. Methamfetamin og glyphosat) på voksne zebrafisk ved hjælp af en enkelt tank. Denne metode er relevant for neurotoksicitet og miljøforskning.
Tilstedeværelsen af neuropatologiske virkninger viste sig i mange år at være det vigtigste endepunkt for vurdering af et kemisk stofs neurotoksicitet. Men i de sidste 50 år er virkningerne af kemikalier på modelarternes adfærd blevet aktivt undersøgt. Gradvist blev adfærdsmæssige endepunkter indarbejdet i neurotoksikologiske screeningsprotokoller, og disse funktionelle resultater bruges nu rutinemæssigt til at identificere og bestemme kemikaliers potentielle neurotoksicitet. Adfærdsmæssige analyser hos voksne zebrafisk giver et standardiseret og pålideligt middel til at studere en bred vifte af adfærd, herunder angst, social interaktion, læring, hukommelse og afhængighed. Adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk involverer typisk at placere fisken i en eksperimentel arena og registrere og analysere deres adfærd ved hjælp af videosporingssoftware. Fisk kan udsættes for forskellige stimuli, og deres adfærd kan kvantificeres ved hjælp af en række forskellige målinger. Den nye tanktest er en af de mest accepterede og udbredte tests til at studere angstlignende adfærd hos fisk. Shoaling og social præference test er nyttige til at studere zebrafiskens sociale adfærd. Denne analyse er særlig interessant, da hele stimens opførsel studeres. Disse analyser har vist sig at være meget reproducerbare og følsomme over for farmakologiske og genetiske manipulationer, hvilket gør dem til værdifulde værktøjer til at studere de neurale kredsløb og molekylære mekanismer, der ligger til grund for adfærd. Derudover kan disse assays anvendes i lægemiddelscreening til at identificere forbindelser, der kan være potentielle modulatorer af adfærd.
Vi vil i dette arbejde vise, hvordan man anvender adfærdsmæssige værktøjer i fiskeneurotoksikologi, analyserer effekten af metamfetamin, et rekreativt stof og glyphosat, et miljøforurenende stof. Resultaterne viser det signifikante bidrag fra adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk til forståelsen af de neurotoksikologiske virkninger af miljøforurenende stoffer og lægemidler, ud over at give indsigt i de molekylære mekanismer, der kan ændre neuronal funktion.
Zebrafisken (Danio rerio) er en populær model hvirveldyrarter til økotoksikologi, lægemiddelopdagelse og sikkerhedsfarmakologiske undersøgelser. Dens lave omkostninger, veletablerede molekylære genetiske værktøjer og bevarelse af vigtige fysiologiske processer involveret i morfogenese og vedligeholdelse af nervesystemet gør zebrafisk til en ideel dyremodel til neurovidenskabelig forskning, herunder neuroadfærdsmæssig toksikologi 1,2. Det vigtigste endepunkt for evaluering af neurotoksiciteten af et kemikalie var indtil for nylig tilstedeværelsen af neuropatologiske virkninger. På det seneste er adfærdsmæssige endepunkter imidlertid blevet indarbejdet i neurotoksikologiske screeningsprotokoller, og disse funktionelle resultater bruges nu almindeligvis til at identificere og bestemme den potentielle neurotoksicitet af kemikalier 3,4. Desuden er adfærdsmæssige endepunkter yderst relevante fra et økologisk synspunkt, da selv en meget mild adfærdsændring hos fisk kan bringe dyrets overlevelse under naturlige forholdi fare 5.
Et af de mest anvendte adfærdsanalyser i voksen zebrafiskforskning er novel tank test (NTT), som måler angstlignende adfærd 6,7. I dette assay udsættes fisk for nyhed (fisk placeres i en ukendt tank), en mild aversiv stimulus og deres adfærdsmæssige reaktioner observeres. NTT bruges til at vurdere basal lokomotorisk aktivitet, geotaxis, frysning og uregelmæssige bevægelser af fisk, hovedsageligt. Uregelmæssig8 er kendetegnet ved pludselige retningsændringer (zigzagging) og gentagne episoder af accelerationer (darting). Det er en alarmreaktion og observeres normalt før eller efter fryseepisoder. Fryseadfærd svarer til en fuldstændig ophør af fiskens bevægelser (undtagen operkulære og okulære bevægelser), mens den er på bunden af tanken, til forskel fra immobilitet forårsaget af sedation, hvilket forårsager hypolokomotion, akinesi og synkende8. Frysning er normalt relateret til en høj tilstand af stress og angst og er også en del af underdanig adfærd. Kompleks adfærd er fremragende indikatorer for tilstanden af angst hos dyr. NTT har vist sig at være følsom over for farmakologisk og genetisk manipulation9, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til at studere det neurale grundlag for angst og relaterede lidelser.
Zebrafisk er en meget social art, så vi kan måle en bred vifte af social adfærd. Shoaling test (ST) og social præference test (SPT) er de mest anvendte assays til vurdering af social adfærd10. ST måler fiskens tendens til at gruppere11 ved at kvantificere deres rumlige adfærd og bevægelsesmønstre. ST er nyttig til at studere gruppedynamik, lederskab, social læring og forståelse af mange fiskearters sociale adfærd12. SPT i voksne zebrafisk blev tilpasset fra Crawleys præference for social nyhedstest for mus13 og blev hurtigt et populært adfærdsassay til undersøgelse af social interaktion i denne modelart14. Disse to tests er også blevet tilpasset til brug i lægemiddelscreeningsanalyser og har vist løfte om at identificere nye forbindelser, der modulerer social adfærd15,16.
Generelt er adfærdsmæssige assays hos voksne zebrafisk kraftfulde værktøjer, der kan give værdifuld information om adfærdsmekanismerne eller neurofænotyperne af aktive forbindelser og misbrugte stoffer17. Denne protokol beskriver, hvordan man implementerer disse adfærdsmæssige værktøjer7 med grundlæggende materielle ressourcer, og hvordan man anvender dem i toksicitetsanalyser for at karakterisere virkningerne af en bred vifte af neuroaktive forbindelser. Derudover vil vi se, at de samme tests kan anvendes til at vurdere de neuroadfærdsmæssige virkninger af akut eksponering for en neuroaktiv forbindelse (metamfetamin), men også for at karakterisere disse virkninger efter kronisk eksponering for miljøkoncentrationer af et pesticid (glyphosat).
Karakteristisk angstadfærd observeret i NTT er blevet positivt korreleret med serotoninniveauer analyseret i hjerner21. For eksempel, efter eksponering for para-chlorphenylalanin (PCPA), en hæmmer af 5-HT biosyntese, fisk udviste positiv geotaxis samt nedsat hjerne 5-HT niveauer22, resultater meget lig dem, der opnås med METH. Derfor antyder faldet i hjernens serotoninniveauer og visningen af positiv geotaxis i METH-eksponeret zebrafisk, at angstadfærden produceret af l…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af “Agencia Estatal de Investigación” fra det spanske ministerium for videnskab og innovation (projekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz blev støttet af et ph.d.-stipendium (PRE2018-083513) medfinansieret af den spanske regering og Den Europæiske Socialfond (ESF).
Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |