Tek Bir Tankta Davranış Testleri Bataryası Kullanılarak Yetişkin Danio rerio'da Nörotoksisite Değerlendirmesi
Summary
Burada, kimyasalların (örneğin, metamfetamin ve glifosat) yetişkin zebra balığı üzerindeki potansiyel nörotoksik etkilerini tek bir tank kullanarak etkili bir şekilde belirlemek için yeni tank, Shoaling ve sosyal tercih testleri dahil olmak üzere kapsamlı bir davranışsal test bataryası sunuyoruz. Bu yöntem nörotoksisite ve çevresel araştırmalarla ilgilidir.
Abstract
Nöropatolojik etkilerin varlığının, uzun yıllar boyunca, bir kimyasal maddenin nörotoksisitesini değerlendirmek için ana son nokta olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, son 50 yılda, kimyasalların model türlerin davranışları üzerindeki etkileri aktif olarak araştırılmıştır. Aşamalı olarak, davranışsal uç noktalar nörotoksikolojik tarama protokollerine dahil edildi ve bu fonksiyonel sonuçlar artık kimyasalların potansiyel nörotoksisitesini tanımlamak ve belirlemek için rutin olarak kullanılıyor. Yetişkin zebra balıklarındaki davranış tahlilleri, kaygı, sosyal etkileşim, öğrenme, hafıza ve bağımlılık dahil olmak üzere çok çeşitli davranışları incelemek için standartlaştırılmış ve güvenilir bir araç sağlar. Yetişkin zebra balıklarında davranışsal testler tipik olarak balığın deneysel bir alana yerleştirilmesini ve video izleme yazılımı kullanılarak davranışlarının kaydedilmesini ve analiz edilmesini içerir. Balıklar çeşitli uyaranlara maruz kalabilir ve davranışları çeşitli ölçümler kullanılarak ölçülebilir. Yeni tank testi, balıklarda anksiyete benzeri davranışları incelemek için en çok kabul gören ve yaygın olarak kullanılan testlerden biridir. Sürü ve sosyal tercih testleri, zebra balıklarının sosyal davranışlarını incelemede faydalıdır. Bu tahlil, tüm sürünün davranışı incelendiği için özellikle ilginçtir. Bu tahlillerin farmakolojik ve genetik manipülasyonlara karşı yüksek oranda tekrarlanabilir ve duyarlı olduğu kanıtlanmıştır, bu da onları davranışın altında yatan nöral devreleri ve moleküler mekanizmaları incelemek için değerli araçlar haline getirir. Ek olarak, bu tahliller, potansiyel davranış modülatörleri olabilecek bileşikleri tanımlamak için ilaç taramasında kullanılabilir.
Bu çalışmada, eğlence amaçlı bir uyuşturucu olan metamfetamin ve çevresel bir kirletici olan glifosatın etkisini analiz ederek balık nörotoksikolojisinde davranışsal araçların nasıl uygulanacağını göstereceğiz. Sonuçlar, yetişkin zebra balıklarında davranışsal testlerin, çevresel kirleticilerin ve ilaçların nörotoksikolojik etkilerinin anlaşılmasına önemli katkısını göstermenin yanı sıra, nöronal işlevi değiştirebilecek moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlar.
Introduction
Zebra balığı (Danio rerio), ekotoksikoloji, ilaç keşfi ve güvenlik farmakolojisi çalışmaları için popüler bir model omurgalı türüdür. Düşük maliyeti, köklü moleküler genetik araçları ve sinir sisteminin morfogenezi ve bakımında yer alan temel fizyolojik süreçlerin korunması, zebra balığını nörodavranışsal toksikoloji de dahil olmak üzere sinirbilim araştırmaları için ideal bir hayvan modeli haline getirir 1,2. Bir kimyasalın nörotoksisitesini değerlendirmek için ana son nokta, yakın zamana kadar nöropatolojik etkilerin varlığıydı. Bununla birlikte, son zamanlarda, davranışsal uç noktalar nörotoksikolojik tarama protokollerine dahil edilmiştir ve bu fonksiyonel sonuçlar artık kimyasalların potansiyel nörotoksisitesini tanımlamak ve belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 3,4. Ayrıca, balıklarda çok hafif bir davranış değişikliği bile hayvanın doğal koşullarda hayatta kalmasını tehlikeye atabileceğinden, davranışsal uç noktalar ekolojik açıdan oldukça önemlidir5.
Yetişkin zebra balığı araştırmalarında en çok kullanılan davranış testlerinden biri, anksiyete benzeri davranışları ölçen yeni tank testidir(NTT)6,7. Bu tahlilde, balıklar yeniliğe maruz bırakılır (balıklar bilinmeyen bir tanka yerleştirilir), hafif bir caydırıcı uyaran ve davranışsal tepkileri gözlenir. NTT, esas olarak balıkların bazal lokomotor aktivitesini, jeotaksisini, donmasını ve düzensiz hareketlerini değerlendirmek için kullanılır. Düzensiz8, ani yön değişiklikleri (zikzak) ve tekrarlanan hızlanma bölümleri (darting) ile karakterizedir. Bu bir alarm reaksiyonudur ve genellikle donma olaylarından önce veya sonra gözlenir. Donma davranışı, hipolokomasyona, akineziye ve batmaya neden olan sedasyonun neden olduğu hareketsizlikten farklı olarak, tankın dibindeyken balığın hareketlerinin (operküler ve oküler hareketler hariç) tamamen durmasına karşılık gelir8. Donma genellikle yüksek stres ve kaygı durumuyla ilgilidir ve aynı zamanda itaatkar davranışın bir parçasıdır. Karmaşık davranışlar, hayvanların kaygı durumunun mükemmel göstergeleridir. NTT’nin farmakolojik ve genetik manipülasyona duyarlı olduğu gösterilmiştir9, bu da onu anksiyete ve ilgili bozuklukların sinirsel temelini incelemek için değerli bir araç haline getirir.
Zebra balığı oldukça sosyal bir türdür, bu nedenle çok çeşitli sosyal davranışları ölçebiliriz. Sığlık testi (ST) ve sosyal tercih testi (SPT), sosyal davranışı değerlendirmek için en çok kullanılan testlerdir10. ST, balıkların uzamsal davranışlarını ve hareket kalıplarını ölçerek11 bir araya gelme eğilimini ölçer. ST, grup dinamiklerini, liderliği, sosyal öğrenmeyi incelemek ve birçok balık türünün sosyal davranışını anlamak için yararlıdır12. Yetişkin zebra balıklarındaki SPT, Crawley’nin fareler13 için sosyal yenilik testi tercihinden uyarlandı ve bu model türlerde14 sosyal etkileşim çalışması için hızla popüler bir davranışsal test haline geldi. Bu iki test aynı zamanda ilaç tarama testlerinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır ve sosyal davranışı modüle eden yeni bileşiklerin tanımlanması için umut vaat etmiştir 15,16.
Genel olarak, yetişkin zebra balıklarındaki davranışsal tahliller, aktif bileşiklerin ve kötüye kullanılan ilaçların davranış mekanizmaları veya nörofenotipleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilen güçlü araçlardır17. Bu protokol, bu davranışsal araçların7 temel malzeme kaynaklarıyla nasıl uygulanacağını ve çok çeşitli nöroaktif bileşiklerin etkilerini karakterize etmek için bunların toksisite deneylerinde nasıl uygulanacağını detaylandırır. Ek olarak, aynı testlerin nöroaktif bir bileşiğe (metamfetamin) akut maruziyetin nörodavranışsal etkilerini değerlendirmek için ve aynı zamanda bir pestisitin (glifosat) çevresel konsantrasyonlarına kronik maruziyetten sonra bu etkileri karakterize etmek için de uygulanabileceğini göreceğiz.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTT’de gözlenen karakteristik anksiyete davranışları, beyinlerde analiz edilen serotonin düzeyleri ile pozitif korelasyon göstermiştir21. Örneğin, 5-HT biyosentezinin bir inhibitörü olan para-klorofenilalanine (PCPA) maruz kaldıktan sonra, balıklar pozitif jeotaksilerin yanı sıra beyin 5-HT seviyelerinde22 azalma sergiledi, bu da METH ile elde edilenlere çok benzer sonuçlar verdi. Bu nedenle, METH’e maruz kalan zebra balıklarında beyin serotonin seviyeler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı’ndan “Agencia Estatal de Investigación” (proje PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezi (CEX2018-000794-S) tarafından desteklenmiştir. Juliette Bedrossiantz, İspanyol Hükümeti ve Avrupa Sosyal Fonu (ESF) tarafından ortaklaşa finanse edilen bir doktora bursu (PRE2018-083513) ile desteklenmiştir.
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
References
- Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
- Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118 (2021).
- Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591 (2015).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).
- Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
- . Social behavior in Zebrafish Available from: https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012)
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
- Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435 (2020).
- Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057 (2021).
- Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319 (2021).
- Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702 (2021).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, (2005).
- Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253 (2021).
- Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
- Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
- Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467 (2019).
- Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
- Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Cachat, J. M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).
- Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
- Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).
- Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).
