在这里,描述了一种用药物和植物提取物喂养 果蝇 的方法,并通过分析果蝇粪便沉积物来评估它们对胃肠道的影响。药物治疗的苍蝇可以用作进一步研究的模型。
为了研究人类胃肠道生理学,生物医学科学家依赖于模式生物的使用。尽管许多研究人员使用小鼠作为模型来研究肠道功能,但只有少数报告关注黑腹果蝇(D. melanogaster)。与小鼠相比,果蝇具有许多优点,例如生命周期短、成本效益高且维护简单,并且没有伦理问题。此外,哺乳动物的胃肠道生理学、解剖学和信号通路在黑腹果蝇中高度保守。植物提取物传统上用于治疗腹泻和便秘。例如,番石榴(P. guajava)是热带地区最著名的止泻药之一。然而,没有研究评估止泻药和泻药以及植物提取物对黑腹果蝇的作用,并且与哺乳动物相比,果蝇是否可能发生类似的作用(例如,在止泻药的情况下,粪便沉积物更小、更集中、更丰富)是否可能发生。在这项研究中,番石榴在呈现腹泻表型的黑腹果蝇菌株中证明了由番石榴诱导的止泻作用。使用添加染料的食物监测苍蝇产生的粪便样本。该协议概述了用于用药物制备食物的方法,评估以这些食物制剂为食的苍蝇的粪便沉积物,并解释获得的数据。
胃肠道 (GI) 也称为消化道,负责营养物质的消化和吸收以及未消化产物的排泄1.胃肠道容易受到一系列疾病的影响,这些疾病会引起不适、疼痛和日常生活中断。胃肠道疾病包括腹痛和不适、腹胀、胃灼热、消化不良或消化不良、恶心、呕吐、腹泻和便秘2.腹泻是胃肠道疾病3 最常见的症状,它被定义为在 24 小时内至少有 3 次稀便和水样便的疾病4。腹泻由多种病原体引起,包括细菌、病毒、寄生虫、真菌,也可能由药物引起 5,6。在世界范围内,腹泻仍然是 5 岁以下儿童死亡的第二大原因7.虽然腹泻可以自行消退,但如果持续超过几天,也可能表明存在更严重的潜在疾病。
为了研究肠道,研究人员转向小鼠、大鼠和猪等动物模型 8,9。然而,使用这些动物可能既昂贵又耗时,因为它们需要专门的设施和道德考虑。最近的研究表明,黑腹果蝇可以作为研究胃肠道的模型,并研究一些机制,例如维持再生稳态、免疫衰老的发展、上皮屏障功能的丧失和代谢稳态的下降10,11。D. melanogaster,被称为果蝇,与人类具有高度的遗传同源性;大约 75% 的人类疾病基因被认为在苍蝇12 中具有功能同源物。它们还有一个简单的消化系统,包括前肠、中肠和后肠13。黑腹果蝇易于在实验室培养,可以以不同的方式进行基因改造14.因此,使用黑腹果蝇进行体内测试是一种强大的工具,使研究人员能够在受控环境中研究复杂的生物过程。
根据世界卫生组织 (WHO) 的数据,生活在发展中国家的约 80% 的人使用传统医学来满足其基本卫生需求15.药用植物的大量使用可以解释为它们易于获得、价格低廉且副作用小16.草药疗法中使用的主要植物部分包括叶子、树皮、根、种子17,而主要制备方法是输液、煎煮和浸渍18。这些草药含有植物化学物质,如生物碱、萜类、类黄酮、类固醇、单宁和碳水化合物19,对人体有治疗作用。人们使用各种药用植物来治疗胃肠道疾病,如腹泻、胃痛和痢疾20.例如,番石榴是世界上最常用的治疗腹泻的植物之一。各种药理学和临床测试已经表明其安全性,这使其成为研究21,22 的良好止泻候选药物。然而,草药的主要局限性是缺乏效率和安全性评估,以及缺乏关于所用植物提取物成分的明确和完整的信息23。为了验证草药的有效性和安全性,需要一种涉及实验和临床验证的系统方法,并且该方法应得到来自体内和体外研究的足够数据的支持。
为了评估传统疗法在治疗腹泻方面的疗效,近几十年来,小鼠和大鼠的使用一直占主导地位24,25。由于前面提到的主要优点,即易用性、价格实惠、可复制、保守的果蝇和哺乳动物之间的吸收和消化功能,我们建议使用黑腹果蝇作为模型来评估植物的止泻活性。黑腹果蝇的腹泻表型可以表征为几个特征,包括粪便沉积物的丰度增加、沉积物大小更大、颜色较浅(浓度较低)和粪便物质较高26。这种表型可以使用各种参数进行量化:粪便沉积物数量、沉积物总面积、平均亮度和总综合光密度 (IOD)。总IOD定义为沉积物的总染料含量,即排泄的粪便总量27。以前,已经开发了一种分析黑腹果蝇粪便沉积物的测定法 27,28。在该测定中,粪便的最终读取器(T.U.R.D.)被用作粪便分析工具,可以检查粪便沉积物的数量,大小和轻度,从而监测果蝇的肠道生理学。然而,这种方法从未用于评估果蝇的腹泻表型。离子转运肽 (ITP) 基因是口渴和排泄的重要内分泌调节剂,将水稳态与黑腹果蝇的摄食相结合。在最近的一项研究中,研究表明,食物在整个胃肠道中的运输速度和排便事件的频率因 ITP 过表达而降低,而 ITP 敲除则增加。本研究的作者将后一种表型描述为腹泻29.
在该协议中,通过使用ITPi菌株作为腹泻模型,采用粪便沉积测定的修改版本来评估抗腹泻剂(即番石榴叶提取物)对黑腹果蝇胃肠道的影响。该方法的总体目标是:1)提供一种简单可靠的方法来评估药物和植物提取物的止泻作用,以及2)通过应用生物活性引导的方法,允许发现负责植物提取物中止泻作用的生物活性化合物。
由于黑腹果蝇与人类之间的基因相似性,黑腹果蝇已被广泛接受为各种生物过程的模型36.使用 D. melanogaster 作为研究肠道的模型很普遍,并且 T.U.R.D. 的应用已被用于估计粪便沉积的数量、面积和数量。然而,表型检测方法尚未用于评估果蝇的腹泻。因此,该协议引入了一种新方法,通过检测粪便沉积物来粗略评估腹泻的存在。
粪便沉积是肠道功能和健康的重要指标37.在此背景下,提出了一种在含药培养基上饲养 黑腹果蝇 的方法,以研究粪便沉积物的各种参数。通过监测沉积物的数量,可以确定排便的频率并评估药物是否对肠道运输有任何影响。可以测量沉积物的总面积来评估粪便的浓度和稀释度,这是决定肠道整体健康的重要因素。此外,总积分光密度 (IOD) 可用于检测沉积物中存在的粪便物质总量。该协议提供了一种有效的方法来筛选和评估影响肠道的药物以及植物提取物。当 黑腹果蝇 被用作模式生物时,可以评估潜在药物的疗效,这有助于加速药物发现过程。通过将这种方法应用于植物提取物,研究人员可以帮助验证它们作为止泻剂的用途。
使用该方案研究黑腹果蝇中的粪便沉积物时,需要考虑几个关键步骤。首先,必须计算在培养基中达到所需药物浓度所需的质量。此外,在将药物添加到培养基中时,确保良好的制备条件很重要,因为高温会降解药物并影响其效力。其次,雌性苍蝇的选择在该协议中很重要。重要的是使用处女雌性苍蝇,以避免处女和交配雌性之间的粪便输出量差异。例如,处女雌性产生的斑点比交配雌性更圆,交配雌性往往比处女雌性排泄更多的粪便物质27,28。因此,建议在封闭8小时之前收集苍蝇,以确保所有收集的雌性都是处女。此外,被测试的苍蝇应该强壮健康,因为它们的健康会影响食物摄入量和粪便输出量。例如,翅膀形状异常的苍蝇可能难以获得食物。最后,要成功使用 T.U.R.D.,块大小(像素)和偏移设置至关重要。由于图像的光对比度不同,可能需要尝试不同的设置,以尽可能最好地识别粪便沉积物。
尽管所提出的方法有效,但存在一些局限性。一是培养基中药物浓度的准确性。当培养基在制备过程中被加热时,一些水可能会蒸发,从而影响药物的浓度。另一个限制是培养皿的扫描。培养皿的某些部分(即边缘)未被扫描,这可能导致对总粪便沉积物的错误计算。此外,苍蝇不会在培养皿的顶部和底部盖上产生相同数量的粪便沉积物。由于它们往往会在底盖上产生更多的沉积物,因此顶盖和底盖之间的分析标准偏差可能很高,这可能会影响结果的准确性。
使用该协议,研究人员可以研究 黑腹果蝇的腹泻。通过对含药培养基进行改性,该方法可用于筛选止泻植物,为药物发现提供了一种新的方法。几个世纪以来,传统医学和天然产品一直被用来治疗不同的疾病,包括胃肠道疾病。通过使用该协议来评估植物提取物对粪便沉积物的功效,可以确定肠道疾病的潜在新疗法,并可以提供将其用作止泻药的科学原理。这种方法可以为药物发现和民族药理学领域做出有价值的贡献。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Martina Gáliková 博士为我们提供 果蝇 菌株。我们感谢Michelle Crozatier-Borde和Marc Haenlin团队对我们的研究提供反馈,并帮助我们改进我们的模型。我们要感谢Napo Pharmaceuticals Company为我们提供药物Crofelemer。作者还感谢客座编辑Hugues Petitjean博士为我们提供了发表该协议的机会。这项研究由国家研究署(ANR)在ANR-22-CE03-0001-01项目下资助。
Chemical & Food medium | |||
Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
Crofelemer | Napo pharmaceuticals | – | – |
Ethanol 96% | – | – | – |
Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
Materials | |||
Beaker | DWK LIFE SCIENCE | – | 250 mL |
Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
CO2 tank | – | – | – |
Erlen Meyer flask | – | – | 500 mL (for extraction) |
Filter paper grade | Whatman | – | 3 mm chr. |
Flowbuddy socle | Genesis | – | – |
Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | – |
Flystuff Blow gun | Genesis | – | – |
Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | – | – |
Flystuff Foot pedal | Genesis | – | – |
Forceps | Dumostar | 11295-51 | – |
Graduated cylinder | – | – | 100 mL |
Inox spatula | – | – | – |
Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | – |
Paintbrush | – | – | – |
Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
Round-bottom flask | – | – | 500 mL (for evaporation) |
Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
Whisk | – | – | – |
Equipments | |||
Chiller | HUBER | Minichiller | – |
Heating bath | BÜCHI | B-490 | – |
Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | – | Magnetic stirrer hot plate |
Incubator | Memmert | – | HPP110eco |
Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | – |
Scanner | Epson | V850 pro | – |
Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | – |
Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | – |
Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | – |
Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | – |