Strukturelle og biokemiske undersøgelser af humane membrantransportører kræver milligram mængder stabilt, intakt og homogent protein. Her beskriver vi skalerbare metoder til at screene, udtrykke og rense transportørtransportører af menneskeligt opløst stof ved hjælp af kodonoptimerede gener.
Opløste bærere (SLC’er) er membrantransportører, der importerer og eksporterer en række endogene og eksogene substrater, herunder ioner, næringsstoffer, metabolitter, neurotransmittere og lægemidler. På trods af at den har vist sig at være attraktive terapeutiske mål og markører for sygdom, er denne gruppe proteiner stadig relativt underdrugged af nuværende lægemidler. Lægemiddelforskningsprojekter for disse transportører hæmmes af begrænset strukturel, funktionel og fysiologisk viden, i sidste ende på grund af vanskelighederne med ekspression og oprensning af denne klasse af membranindlejrede proteiner. Her demonstrerer vi metoder til at opnå milligram mængder af humane SLC-transportørproteiner med høj renhed ved hjælp af kodonoptimerede gensekvenser. I forbindelse med en systematisk udforskning af konstruktionsdesign og high-throughput ekspression sikrer disse protokoller bevarelsen af målproteinernes strukturelle integritet og biokemiske aktivitet. Vi fremhæver også kritiske trin i den eukaryote celleekspression, affinitetsoprensning og størrelsesudelukkelseskromatografi af disse proteiner. I sidste ende giver denne arbejdsgang rene, funktionelt aktive og stabile proteinpræparater, der er egnede til strukturbestemmelse med høj opløsning, transportundersøgelser, småmolekyleengagementsanalyser og in vitro-screening med høj kapacitet.
Membranproteiner har længe været mål for både forskere og medicinalindustrien. Af disse er de opløste bærere (SLC’er) en familie af over 400 sekundære transportørgener kodet i det menneskelige genom1. Disse transportører er involveret i import og eksport af adskillige molekyler, herunder ioner2, neurotransmittere3, lipider 4,5,6,7, aminosyrer8, næringsstoffer 9,10,11 og lægemidler 12. Med en sådan bredde af substrater er disse proteiner også impliceret i en række patofysiologier gennem transport af toksiner13, transport af og hæmning af misbrugsstoffer 14,15 eller skadelige mutationer16. Bakterielle homologer har tjent som prototyper for den grundlæggende transportmekanisme i flere SLC-familier 17,18,19,20,21,22,23,24,25. I modsætning til humane proteiner udtrykkes prokaryote ortologer ofte bedre i det velforståede Escherichia coli-ekspressionssystem 26,27 og er mere stabile i de mindre vaskemidler, der giver velordnede krystaller til røntgenkrystallografi28. Imidlertid komplicerer sekvens- og funktionelle forskelle brugen af disse fjernt beslægtede proteiner til lægemiddelopdagelse29,30. Derfor er direkte undersøgelse af det humane protein ofte nødvendigt for at dechiffrere virkningsmekanismen for lægemidler rettet mod SLC’er 31,32,33,34,35. Mens de seneste fremskridt inden for kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har muliggjort strukturel karakterisering af SLC’er under mere native-lignende forhold36,37, er vanskeligheder med at udtrykke og rense disse proteiner fortsat en udfordring for at udvikle målrettet terapi og diagnostik.
For at afhjælpe denne udfordring har RESOLUTE-konsortiet (re-solute.eu) udviklet ressourcer og protokoller til storskala ekspression og oprensning af humane SLC-familieproteiner38. Med udgangspunkt i codonoptimerede gener har vi udviklet metoder til high-throughput kloning og screening af SLC-konstruktioner. Disse metoder blev systematisk anvendt på hele familien af SLC’er, generne blev klonet ind i BacMam virusekspressionssystemet, og proteinekspressionen blev testet i humane cellelinjer39 baseret på tidligere beskrevne metoder til kloning med høj kapacitet og ekspressionstest40. Sammenfattende klones SLC-genet fra pDONR221-plasmidet til en pHTBV1.1-vektor. Denne konstruktion bruges efterfølgende til at transponere genet af interesse til en bacmidvektor til transfektering af insektceller, som inkluderer en cytomegaloviruspromotor og forstærkerelementer til ekspression i pattedyrceller. Det resulterende baculovirus kan anvendes til at transducere pattedyrceller til ekspression af mål-SLC-proteinet.
Vi videreudviklede standardiserede metoder til storskala ekspression og stabil oprensning af udvalgte SLC’er (figur 1). Denne protokol indeholder flere kontrolpunkter for at lette effektiv fejlfinding og minimere variabilitet mellem eksperimenter. Især rutinemæssig overvågning af proteinekspression og lokalisering samt optimering i lille skala af oprensningsbetingelser for individuelle mål blev hjulpet af Strep og Green Fluorescent Protein (GFP) tags41,42.
I sidste ende kan disse kemisk rene og strukturelt homogene proteinprøver anvendes til strukturel bestemmelse ved røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), biokemiske målengagementsassays, immunisering til bindemiddelgenerering og cellefrie funktionelle undersøgelser via rekonstitution i kemisk definerede liposomer.
Udviklingen af SLC-målrettede terapier er forblevet hæmmet på grund af fraværet af systematisk karakterisering af transportørfunktionen. Dette har ført til uforholdsmæssigt færre lægemidler rettet mod denne proteinklasse i forhold til GPCR’er og ionkanaler63, på trods af deres mange roller i normale og patofysiologiske processer. RESOLUTE er et internationalt konsortium, der har til formål at udvikle banebrydende forskningsteknikker og værktøjer til at fremskynde og forbedre den nuvæ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev udført inden for RESOLUTE-projektet. RESOLUTE har modtaget støtte fra fællesforetagendet for initiativet om innovative lægemidler 2 i henhold til tilskudsaftale nr. 777372. Dette fællesforetagende modtager støtte fra EU’s forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 og EFPIA. Denne artikel afspejler kun forfatternes synspunkter, og hverken IMI eller Den Europæiske Union og EFPIA er ansvarlige for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri. pHTBV-plasmidet blev venligst leveret af professor Frederick Boyce (Harvard).
3C protease | Produced in-house | ||
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |