Strukturelle og biokjemiske studier av menneskelige membrantransportører krever milligram mengder stabilt, intakt og homogent protein. Her beskriver vi skalerbare metoder for å screene, uttrykke og rense menneskelige løsemiddelbærere ved hjelp av kodonoptimaliserte gener.
Løsemiddelbærere (SLC) er membrantransportører som importerer og eksporterer en rekke endogene og eksogene substrater, inkludert ioner, næringsstoffer, metabolitter, nevrotransmittere og legemidler. Til tross for å ha dukket opp som attraktive terapeutiske mål og markører for sykdom, er denne gruppen proteiner fortsatt relativt undermedisinert av dagens legemidler. Narkotikaforskningsprosjekter for disse transportørene hindres av begrenset strukturell, funksjonell og fysiologisk kunnskap, til slutt på grunn av vanskelighetene med ekspresjon og rensing av denne klassen av membraninnebygde proteiner. Her demonstrerer vi metoder for å oppnå høy renhet, milligram mengder humane SLC-transportørproteiner ved hjelp av kodonoptimaliserte gensekvenser. I forbindelse med en systematisk utforskning av begrepsdesign og høy gjennomstrømningsuttrykk, sikrer disse protokollene bevaring av målproteinenes strukturelle integritet og biokjemiske aktivitet. Vi fremhever også kritiske trinn i eukaryot celleuttrykk, affinitetsrensing og størrelsesekskluderingskromatografi av disse proteinene. Til syvende og sist gir denne arbeidsflyten rene, funksjonelt aktive og stabile proteinpreparater som er egnet for strukturbestemmelse med høy oppløsning, transportstudier, småmolekylære engasjementsanalyser og høy gjennomstrømning in vitro-screening .
Membranproteiner har lenge vært mål for både forskere og farmasøytisk industri. Av disse er løsemiddelbærerne (SLC) en familie av over 400 sekundære transportørgener kodet i det menneskelige genom1. Disse transportørene er involvert i import og eksport av mange molekyler, inkludert ioner2, nevrotransmittere3, lipider 4,5,6,7, aminosyrer8, næringsstoffer 9,10,11 og legemidler 12. Med en slik bredde av substrater er disse proteinene også involvert i en rekke patofysiologier gjennom transport av toksiner13, transport av og inhibering av rusmidler 14,15 eller skadelige mutasjoner16. Bakterielle homologer har fungert som prototyper for den grunnleggende transportmekanismen til flere SLC-familier: 17,18,19,20,21,22,23,24,25. I motsetning til humane proteiner er prokaryote ortologer ofte bedre uttrykt i det godt forståtte Escherichia coli-ekspresjonssystemet 26,27 og er mer stabile i de mindre vaskemidlene som gir velordnede krystaller for røntgenkrystallografi28. Imidlertid kompliserer sekvens og funksjonelle forskjeller bruken av disse fjernrelaterte proteinene for narkotikaforskning29,30. Følgelig er det ofte nødvendig med direkte studier av det humane proteinet for å dechiffrere virkningsmekanismen til legemidler rettet mot SLC 31,32,33,34,35. Mens de siste fremskrittene i kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har muliggjort strukturell karakterisering av SLC i mer innfødte-lignende forhold36,37, er vanskeligheter med å uttrykke og rense disse proteinene fortsatt en utfordring for å utvikle målrettet terapi og diagnostikk.
For å bøte på denne utfordringen har RESOLUTE-konsortiet (re-solute.eu) utviklet ressurser og protokoller for storskala ekspresjon og rensing av humane SLC-familieproteiner38. Med utgangspunkt i kodonoptimaliserte gener har vi utviklet metoder for høy gjennomstrømningskloning og screening av SLC-konstruksjoner. Disse metodene ble systematisk anvendt på hele familien av SLC, genene ble klonet inn i BacMam virale ekspresjonssystemet, og proteinuttrykket ble testet i humane cellelinjer39 basert på tidligere beskrevne metoder for høy gjennomstrømningskloning og ekspresjonstesting40. Oppsummert klones SLC-genet fra pDONR221-plasmidet til en pHTBV1.1-vektor. Denne konstruksjonen brukes senere til å transponere genet av interesse til en bacmidvektor for transfektering av insektceller, som inkluderer en cytomegaloviruspromotor og forsterkerelementer for ekspresjon i pattedyrceller. Det resulterende baculoviruset kan brukes til å transducere pattedyrceller for ekspresjonen av mål-SLC-proteinet.
Vi videreutviklet standardiserte metoder for storskala ekspresjon og stabil rensing av utvalgte SLC-er (figur 1). Denne protokollen inneholder flere kontrollpunkter for å legge til rette for effektiv feilsøking og minimere variasjonen mellom eksperimenter. Spesielt ble rutinemessig overvåking av proteinuttrykk og lokalisering, samt småskala optimalisering av rensebetingelser for individuelle mål, hjulpet av Strep og Green Fluorescent Protein (GFP) koder41,42.
Til slutt kan disse kjemisk rene og strukturelt homogene proteinprøvene brukes til strukturell bestemmelse ved røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), biokjemiske målengasjementsanalyser, immunisering for bindemiddelgenerering og cellefrie funksjonelle studier via rekonstituering til kjemisk definerte liposomer.
Utviklingen av SLC-målrettede terapier har forblitt hemmet på grunn av fraværet av systematisk karakterisering av transportørfunksjonen. Dette har ført til uforholdsmessig færre legemidler rettet mot denne proteinklassen i forhold til GPCR og ionkanaler63, til tross for deres mange roller i normale og patofysiologiske prosesser. RESOLUTE er et internasjonalt konsortium som har som mål å utvikle banebrytende forskningsteknikker og verktøy for å akselerere og forbedre dagens SLC-forskning….
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble utført innenfor RESOLUTE-prosjektet. RESOLUTE har mottatt støtte fra Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking under tilskuddsavtale No 777372. Dette fellesforetaket mottar støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 og EFPIA. Denne artikkelen gjenspeiler bare forfatternes synspunkter, og verken IMI eller EU og EFPIA er ansvarlig for eventuell bruk av informasjonen som finnes der. pHTBV-plasmidet ble vennlig levert av professor Frederick Boyce (Harvard).
3C protease | Produced in-house | ||
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |