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Biochemistry

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Abstract

Transportadores de solutos (SLCs) são transportadores de membrana que importam e exportam uma gama de substratos endógenos e exógenos, incluindo íons, nutrientes, metabólitos, neurotransmissores e produtos farmacêuticos. Apesar de ter emergido como alvos terapêuticos atraentes e marcadores de doença, esse grupo de proteínas ainda é relativamente subdrogado pelos fármacos atuais. Projetos de descoberta de fármacos para esses transportadores são impedidos por limitados conhecimentos estruturais, funcionais e fisiológicos, em última análise, devido às dificuldades na expressão e purificação dessa classe de proteínas embutidas em membrana. Aqui, demonstramos métodos para obter quantidades de miligramas de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas usando sequências gênicas otimizadas para códons. Em conjunto com uma exploração sistemática do projeto de construção e expressão de alto rendimento, esses protocolos garantem a preservação da integridade estrutural e da atividade bioquímica das proteínas-alvo. Também destacamos etapas críticas na expressão de células eucarióticas, purificação de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho dessas proteínas. Em última análise, esse fluxo de trabalho produz preparações proteicas puras, funcionalmente ativas e estáveis adequadas para determinação de estrutura de alta resolução, estudos de transporte, ensaios de engajamento de moléculas pequenas e triagem in vitro de alto rendimento.

Introduction

As proteínas de membrana têm sido alvos de pesquisadores e indústrias farmacêuticas. Destes, os portadores de solutos (SLCs) são uma família de mais de 400 genes transportadores secundários codificados dentro do genoma humano1. Esses transportadores estão envolvidos na importação e exportação de inúmeras moléculas, incluindo íons2, neurotransmissores3, lipídios 4,5,6,7,aminoácidos8, nutrientes 9,10,11 e fármacos 12. Com tamanha amplitude de substratos, essas proteínas também estão implicadas em uma série de fisiopatologias através do transporte de toxinas13, transporte e inibição por drogas de abuso 14,15 ou mutações deletérias16. Homólogos bacterianos têm servido como protótipos para o mecanismo de transporte fundamental de várias famílias de SLC17,18,19,20,21,22,23,24,25. Em contraste com as proteínas humanas, os ortólogos procarióticos são frequentemente melhor expressos no bem compreendido sistema de expressão de Escherichia coli 26,27 e são mais estáveis nos detergentes menores, que produzem cristais bem ordenados para cristalografia de raios X 28. Entretanto, diferenças de sequência e funcionais dificultam o uso dessas proteínas distantes para a descoberta de fármacos29,30. Consequentemente, o estudo direto da proteína humana é frequentemente necessário para decifrar o mecanismo de ação de drogas direcionadas àsSLCs 31,32,33,34,35. Embora os recentes avanços na Microscopia Crioeletrônica (Cryo-EM) tenham permitido a caracterização estrutural de SLCs em condições mais nativas36,37, a dificuldade em expressar e purificar essas proteínas continua sendo um desafio para o desenvolvimento de terapêuticas e diagnósticos direcionados.

Para amenizar esse desafio, o consórcio RESOLUTE (re-solute.eu) desenvolveu recursos e protocolos para a expressão e purificação em larga escala de proteínas humanas da família SLC38. Começando com genes otimizados para códons, desenvolvemos métodos para clonagem de alto rendimento e triagem de construções SLC. Esses métodos foram sistematicamente aplicados a toda a família de SLCs, os genes foram clonados no sistema de expressão viral BacMam e a expressão da proteína foi testada em linhagens celulares humanas39 com base em métodos previamente descritos para clonagem de alto rendimento e testes de expressão40. Em resumo, o gene SLC é clonado do plasmídeo pDONR221 em um vetor pHTBV1.1. Este construto é posteriormente usado para transpor o gene de interesse para um vetor bacmid para transfecção de células de insetos, que inclui um promotor de citomegalovírus e elementos potencializadores para expressão em células de mamíferos. O baculovírus resultante pode ser usado para transduzir células de mamíferos para a expressão da proteína alvo SLC.

Desenvolvemos ainda métodos padronizados para expressão em larga escala e purificação estável de SLCs selecionadas (Figura 1). Esse protocolo inclui vários pontos de verificação para facilitar a solução de problemas eficaz e minimizar a variabilidade entre os experimentos. Notavelmente, o monitoramento rotineiro da expressão e localização de proteínas, bem como a otimização em pequena escala das condições de purificação para alvos individuais, foram auxiliados por etiquetas Strep e Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

Em última análise, essas amostras de proteínas quimicamente puras e estruturalmente homogêneas podem ser usadas para determinação estrutural por cristalografia de raios X ou microscopia crioeletrônica (Cryo-EM), ensaios bioquímicos de engajamento de alvos, imunização para geração de ligantes e estudos funcionais livres de células via reconstituição em lipossomas quimicamente definidos.

Protocol

NOTA: Todos os genes RESOLUTE SLC otimizados para códons foram depositados no AddGene43, cujos links estão disponíveis na lista de reagentes públicos RESOLUTE44. Esses genes foram clonados no plasmídeo pDONR221 e permitem a clonagem direta dos genes no vetor de destino usando clonagem de recombinação45. Para maximizar o paralelismo, células bacterianas, de insetos e de mamíferos são cultivadas em formato de bloco para produção de bacmid (…

Representative Results

Genes SLC podem ser clonados de plasmídeos resolutos pDONR em vetores BacMam para expressão em mamíferosOs protocolos descritos para clonagem, expressão e purificação provaram ser bem-sucedidos para muitos transportadores SLC em múltiplas dobras proteicas. No entanto, os procedimentos incluem vários pontos de verificação para monitorar o progresso, permitindo a otimização para levar em conta as diferenças na expressão, enovelamento de proteínas, estabilidade dependente de lipídios e d…

Discussion

O desenvolvimento de terapias direcionadas para SLC tem permanecido dificultado devido à ausência de caracterização sistemática da função do transportador. Isso levou a um número desproporcionalmente menor de drogas direcionadas a essa classe de proteínas em relação aos GPCRs e canais iônicos63, apesar de seus inúmeros papéis em processos normais e fisiopatológicos. RESOLUTE é um consórcio internacional que visa desenvolver técnicas e ferramentas de pesquisa de ponta para acelera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi realizado dentro do projeto RESOLUTE. A RESOLUTE recebeu financiamento da Empresa Comum Iniciativa para os Medicamentos Inovadores 2 ao abrigo do acordo de subvenção n.º 777372. Esta Empresa Comum recebe apoio do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia e da EFPIA. Este artigo reflecte apenas a opinião dos autores e nem o IMI, nem a União Europeia e a EFPIA são responsáveis por qualquer utilização que possa ser feita da informação nele contida. O plasmídeo pHTBV foi gentilmente cedido pelo Prof. Frederick Boyce (Harvard).

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
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Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
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