Strukturella och biokemiska studier av mänskliga membrantransportörer kräver milligram mängder av stabilt, intakt och homogent protein. Här beskriver vi skalbara metoder för att screena, uttrycka och rena mänskliga bärare av lösta ämnen med hjälp av kodonoptimerade gener.
Solute bärare (SLC) är membrantransportörer som importerar och exporterar en rad endogena och exogena substrat, inklusive joner, näringsämnen, metaboliter, neurotransmittorer och läkemedel. Trots att denna grupp av proteiner har framstått som attraktiva terapeutiska mål och markörer för sjukdom är den fortfarande relativt underdrogad av dagens läkemedel. Läkemedelsutvecklingsprojekt för dessa transportörer hindras av begränsad strukturell, funktionell och fysiologisk kunskap, ytterst på grund av svårigheterna med att uttrycka och rena denna klass av membraninbäddade proteiner. Här demonstrerar vi metoder för att erhålla stora mängder av humana SLC-transportproteiner med hög renhet med hjälp av kodonoptimerade gensekvenser. I kombination med en systematisk utforskning av konstruktionsdesign och storskaligt uttryck säkerställer dessa protokoll bevarandet av målproteinernas strukturella integritet och biokemiska aktivitet. Vi belyser också kritiska steg i det eukaryota celluttrycket, affinitetsrening och storleksuteslutningskromatografi av dessa proteiner. I slutändan ger detta arbetsflöde rena, funktionellt aktiva och stabila proteinpreparat som är lämpliga för högupplöst strukturbestämning, transportstudier, analyser av småmolekylengagemang och in vitro-screening med hög genomströmning.
Membranproteiner har länge varit måltavlor för både forskare och läkemedelsindustri. Av dessa är de lösta bärarna (SLC) en familj av över 400 sekundära transportgener som kodas i det mänskliga genomet1. Dessa transportörer är involverade i import och export av många molekyler, inklusive joner2, neurotransmittorer3, lipider 4,5,6,7, aminosyror 8, näringsämnen 9,10,11 och läkemedel 12. Med en sådan bredd av substrat är dessa proteiner också inblandade i en rad patofysiologier genom transport av toxiner13, transport av och hämning av missbruksdroger 14,15 eller skadliga mutationer16. Bakteriella homologer har fungerat som prototyper för den grundläggande transportmekanismen för flera SLC-familjer 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Till skillnad från mänskliga proteiner uttrycks prokaryota ortologer ofta bättre i det välförstådda Escherichia coli-uttryckssystemet 26,27 och är mer stabila i de mindre tvättmedlen som ger välordnade kristaller för röntgenkristallografi 28. Sekvens- och funktionsskillnader komplicerar dock användningen av dessa avlägset besläktade proteiner för läkemedelsutveckling29,30. Följaktligen behövs ofta direkta studier av det mänskliga proteinet för att dechiffrera verkningsmekanismen för läkemedel som riktar sig mot SLC 31,32,33,34,35. Även om de senaste framstegen inom kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM) har möjliggjort strukturell karakterisering av SLC:er under mer nativa förhållanden36,37, är svårigheten att uttrycka och rena dessa proteiner fortfarande en utmaning för att utveckla riktade terapier och diagnostik.
För att mildra denna utmaning har Resolute-konsortiet (re-solute.eu) utvecklat resurser och protokoll för storskaligt uttryck och rening av humana proteiner i SLC-familjen38. Med utgångspunkt i kodonoptimerade gener har vi utvecklat metoder för storskalig kloning och screening av SLC-konstrukt. Dessa metoder tillämpades systematiskt på hela familjen av SLC, generna klonades in i BacMam-virusuttryckssystemet och proteinuttrycket testades i humana cellinjer39 baserat på tidigare beskrivna metoder för storskalig kloning och expressionstestning40. Sammanfattningsvis klonas SLC-genen från pDONR221-plasmiden till en pHTBV1.1-vektor. Denna konstruktion används sedan för att transponera genen av intresse till en bacmidvektor för transfektering av insektsceller, som inkluderar en cytomegaloviruspromotor och förstärkarelement för uttryck i däggdjursceller. Det resulterande baculoviruset kan användas för att transducera däggdjursceller för uttryck av målproteinet SLC.
Vi vidareutvecklade standardiserade metoder för storskalig expressionning och stabil rening av utvalda SLC:er (Figur 1). Det här protokollet innehåller flera kontrollpunkter för att underlätta effektiv felsökning och minimera variabiliteten mellan experiment. Rutinmässig övervakning av proteinuttryck och lokalisering, samt småskalig optimering av reningsförhållanden för enskilda mål, underlättades av Strep och Green Fluorescent Protein (GFP) taggar41,42.
I slutändan kan dessa kemiskt rena och strukturellt homogena proteinprover användas för strukturbestämning genom röntgenkristallografi eller kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM), biokemiska målengagemangsanalyser, immunisering för bindemedelsgenerering och cellfria funktionella studier via rekonstituering till kemiskt definierade liposomer.
Utvecklingen av SLC-riktade terapier har förblivit hämmad på grund av frånvaron av systematisk karakterisering av transportörens funktion. Detta har lett till oproportionerligt färre läkemedel som riktar sig mot denna proteinklass jämfört med GPCR och jonkanaler63, trots deras många roller i normala och patofysiologiska processer. RESOLUTE är ett internationellt konsortium som syftar till att utveckla banbrytande forskningstekniker och verktyg för att påskynda och förbättra nuvarand…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete utfördes inom ramen för RESOLUTE-projektet. Resolute har fått finansiering från det gemensamma företaget för initiativet för innovativa läkemedel 2 enligt bidragsavtal nr 777372. Detta gemensamma företag får stöd från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 och EFPIA. Denna artikel återspeglar endast författarnas åsikter och varken IMI eller Europeiska unionen och EFPIA är ansvariga för hur informationen i artikeln används. PHTBV-plasmiden tillhandahölls vänligen av professor Frederick Boyce (Harvard).
3C protease | Produced in-house | ||
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |