Évaluation de la microarchitecture de l’os trabéculaire dans un modèle murin d’ostéoporose
Summary
Ce protocole présente une méthode économique et efficace pour l’évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose en combinant la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) et les techniques de micro-tomodensitométrie (Micro-CT).
Abstract
La microstructure osseuse fait référence à la disposition et à la qualité du tissu osseux au niveau microscopique. Comprendre la microstructure osseuse du squelette est crucial pour mieux comprendre la physiopathologie de l’ostéoporose et améliorer son traitement. Cependant, la manipulation d’échantillons d’os peut être complexe en raison de leurs propriétés dures et denses. Deuxièmement, les logiciels spécialisés rendent le traitement et l’analyse d’images difficiles. Dans ce protocole, nous présentons une solution rentable et facile à utiliser pour l’analyse de la microstructure osseuse trabéculaire. Des étapes et des précautions détaillées sont fournies. La micro-tomodensitométrie est une technique d’imagerie tridimensionnelle (3D) non destructive qui fournit des images à haute résolution de la structure de l’os trabéculaire. Il permet une évaluation objective et quantitative de la qualité osseuse, c’est pourquoi il est largement considéré comme la méthode de référence pour l’évaluation de la qualité osseuse. Cependant, l’histomorphométrie reste indispensable car elle offre des paramètres cruciaux au niveau cellulaire, comblant le fossé entre les évaluations bidimensionnelles (2D) et 3D des échantillons osseux. En ce qui concerne les techniques histologiques, nous avons choisi de décalcifier le tissu osseux puis d’effectuer un enrobage traditionnel à la paraffine. En résumé, la combinaison de ces deux méthodes peut fournir des informations plus complètes et plus précises sur la microstructure osseuse.
Introduction
L’ostéoporose est une maladie osseuse métabolique répandue, en particulier chez les personnes âgées, et est associée à un risque accru de fractures de fragilité. À mesure que l’ostéoporose devient de plus en plus fréquente en Chine1, il y aura une demande croissante pour l’étude des structures osseuses des petits animaux 2,3. Les méthodes précédentes de mesure de la perte osseuse reposent sur les résultats de l’absorptiométrie bidimensionnelle à rayons X à double énergie. Cependant, cela ne tient pas compte des changements dans la microstructure architecturale de l’os trabéculaire, qui est un facteur clé pour la force squelettique4. La microstructure de l’os affecte sa solidité, sa rigidité et sa résistance à la rupture. En comparant la microarchitecture osseuse dans des états normaux et pathologiques, il est possible d’identifier les changements dans la morphologie, la structure et la fonction du tissu osseux causés par l’ostéoporose. Ces informations contribuent à la compréhension du développement de l’ostéoporose et de son association avec d’autres maladies.
L’imagerie par micro-tomodensitométrie (Micro-TDM) est récemment devenue une technique populaire pour l’évaluation de la morphologie osseuse, où elle peut fournir des données précises et complètes sur la structure osseuse et les paramètres de densité tels que la fraction de volume osseux, l’épaisseur et la séparation 5,6. Dans le même temps, les résultats de la micro-tomodensitométrie peuvent être affectés par le logiciel d’analyse7. Différentes méthodes d’acquisition, d’évaluation et de production de rapports d’images sont utilisées par divers systèmes commerciaux de micro-tomodensitométrie. Cette incohérence rend difficile la comparaison et l’interprétation des résultats rapportés par différentes études5. De plus, elle ne peut actuellement pas remplacer l’histomorphométrie osseuse en fournissant aux chercheurs des informations sur les paramètres cellulaires du système squelettique8. Parallèlement, les techniques histologiques permettent d’observer et de mesurer directement la morphologie microscopique de l’os. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) est une technique de coloration couramment utilisée en histologie pour visualiser la structure générale des cellules et des tissus. Il est utilisé pour identifier la présence de tissu osseux et sa microarchitecture.
Cet article utilise la micro-tomodensitométrie combinée à une technique de tranchage tissulaire (coloration à l’hématoxyline-éosine [HE]) pour collecter des images de tissu osseux et effectuer une analyse quantitative de l’os trabéculaire afin d’évaluer les changements de la microstructure osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ostéoporose peut entraîner des fractures fréquentes, coûteuses, douloureuses, invalides ou même mortelles, et affecter gravement la qualité de vie des patients20. Au fil des ans, le modèle d’ovariectomie a été reconnu comme l’une des méthodes standard pour étudier l’ostéoporose21. Le modèle animal préclinique le plus courant pour l’ostéoporose est le rat ovariectomisé (OVX). Malgré cela, la majorité des recherches sur les mécanismes des troubl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par l’Administration provinciale de médecine traditionnelle chinoise du Sichuan (2021YJ0175) et le Projet d’innovation en recherche aux cycles supérieurs de l’École de médecine clinique (LCYJSKT2023-11) de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
