Osteoporoz Fare Modelinde Trabeküler Kemik Mikromimarisinin Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, Hematoksilen-Eozin (HE) boyama ve mikro-bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) tekniklerini birleştirerek osteoporozun fare modelinde kemik mikromimarisinin kantitatif değerlendirilmesi için ekonomik ve etkili bir yöntem sunar.
Abstract
Kemik mikro yapısı, kemik dokusunun mikroskobik düzeyde düzenlenmesini ve kalitesini ifade eder. İskeletin kemik mikro yapısını anlamak, osteoporozun patofizyolojisi hakkında bilgi edinmek ve tedavisini geliştirmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, sert ve yoğun özellikleri nedeniyle kemik örneklerinin işlenmesi karmaşık olabilir. İkincisi, özel yazılımlar görüntü işlemeyi ve analizini zorlaştırır. Bu protokolde, trabeküler kemik mikroyapı analizi için uygun maliyetli ve kullanımı kolay bir çözüm sunuyoruz. Ayrıntılı adımlar ve önlemler verilmiştir. Mikro-BT, trabeküler kemik yapısının yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlayan tahribatsız üç boyutlu (3D) bir görüntüleme tekniğidir. Kemik kalitesinin objektif ve kantitatif değerlendirmesine izin verir, bu nedenle kemik kalitesi değerlendirmesi için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, histomorfometri, kemik örneklerinin iki boyutlu (2D) ve 3D değerlendirmeleri arasındaki boşluğu dolduran önemli hücresel düzeyde parametreler sunduğu için vazgeçilmez olmaya devam etmektedir. Histolojik tekniklere gelince, kemik dokusunu dekalsifiye etmeyi ve ardından geleneksel parafin yerleştirmeyi seçtik. Özetle, bu iki yöntemin birleştirilmesi kemik mikroyapısı hakkında daha kapsamlı ve doğru bilgi sağlayabilir.
Introduction
Osteoporoz, özellikle yaşlılar arasında yaygın bir metabolik kemik hastalığıdır ve kırılganlık kırığı riskinin artmasıyla ilişkilidir. Osteoporoz Çin’dedaha yaygın hale geldikçe1, küçük hayvanların kemik yapılarını incelemek için artan bir talep olacaktır 2,3. Kemik kaybını ölçmenin önceki yöntemleri, iki boyutlu çift enerjili x-ışını absorpsiyometrisinin sonuçlarına dayanmaktadır. Bununla birlikte, bu, iskelet gücü için önemli bir faktör olan trabeküler kemiğin mimari mikro yapısındaki değişiklikleri yakalamaz4. Kemiğin mikro yapısı, mukavemetini, sertliğini ve kırılma direncini etkiler. Normal ve patolojik durumdaki kemik mikromimarisini karşılaştırarak, osteoporozun neden olduğu kemik dokusu morfolojisi, yapısı ve fonksiyonundaki değişiklikler tanımlanabilir. Bu bilgi, osteoporoz gelişiminin ve diğer hastalıklarla ilişkisinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) görüntüleme, kemik hacmi fraksiyonu, kalınlığı ve ayrılması gibi kemik yapısı ve yoğunluk parametreleri hakkında doğru ve kapsamlı veriler sağlayabildiği kemik morfolojisi değerlendirmesi için son zamanlarda popüler bir teknik haline gelmiştir 5,6. Aynı zamanda, Mikro-CT sonuçları analiz yazılımındanetkilenebilir 7. Çeşitli ticari Mikro-BT sistemleri tarafından farklı görüntü elde etme, değerlendirme ve raporlama yöntemleri kullanılmaktadır. Bu tutarsızlık, farklı çalışmalarla bildirilen sonuçların karşılaştırılmasını ve yorumlanmasını zorlaştırmaktadır5. Ayrıca, araştırmacılara iskelet sistemindeki hücresel düzeydeki parametreler hakkında bilgi sağlamada şu anda kemik histomorfometrisinin yerini alamaz8. Bu arada, histolojik teknikler, kemiğin mikroskobik morfolojisinin doğrudan gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin verir. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama, histolojide hücrelerin ve dokuların genel yapısını görselleştirmek için kullanılan yaygın bir boyama tekniğidir. Kemik dokusunun varlığını ve mikro mimarisini tanımlamak için kullanılır.
Bu makale, bir osteoporoz fare modelinde kemik mikroyapısındaki değişiklikleri değerlendirmek için kemik dokusu görüntülerini toplamak ve trabeküler kemiğin kantitatif analizini yapmak için doku dilimleme tekniği (Hematoksilen-Eozin [HE] boyama) ile birlikte Mikro-BT kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporoz, maliyetli olan, ağrıya, sakatlığa ve hatta ölüme neden olabilen ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyebilen sık kırıklara yol açabilir20. Yıllar geçtikçe, ovariektomi modeli osteoporozu incelemek için standart yöntemlerden biri olarak kabul edilmiştir21. Osteoporoz için en yaygın preklinik hayvan modeli yumurtalıklı (OVX) sıçandır. Buna rağmen, osteoporoz da dahil olmak üzere kemik bozukluklarının mekanizmalarına ili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sichuan İl Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi (2021YJ0175) ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Klinik Tıp Okulu (LCYJSKT2023-11) Lisansüstü Araştırma İnovasyon Projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
