Evaluatie van de microarchitectuur van het trabeculaire bot in een muismodel met osteoporose
Summary
Dit protocol presenteert een economische en efficiënte methode voor kwantitatieve evaluatie van botmicroarchitectuur in een muismodel van osteoporose door Hematoxyline-Eosine (HE) kleuring en micro-computertomografie (Micro-CT) technieken te combineren.
Abstract
Botmicrostructuur verwijst naar de rangschikking en kwaliteit van botweefsel op microscopisch niveau. Inzicht in de botmicrostructuur van het skelet is cruciaal om inzicht te krijgen in de pathofysiologie van osteoporose en de behandeling ervan te verbeteren. Het hanteren van botmonsters kan echter complex zijn vanwege hun harde en dichte eigenschappen. Ten tweede maakt gespecialiseerde software beeldverwerking en -analyse moeilijk. In dit protocol presenteren we een kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke oplossing voor trabeculaire botmicrostructuuranalyse. Er worden gedetailleerde stappen en voorzorgsmaatregelen gegeven. Micro-CT is een niet-destructieve driedimensionale (3D) beeldvormingstechniek die beelden met een hoge resolutie van de trabeculaire botstructuur oplevert. Het maakt de objectieve en kwantitatieve evaluatie van de botkwaliteit mogelijk, en daarom wordt het algemeen beschouwd als de gouden standaardmethode voor de beoordeling van de botkwaliteit. Histomorfometrie blijft echter onmisbaar omdat het cruciale parameters op cellulair niveau biedt en de kloof overbrugt tussen tweedimensionale (2D) en 3D-beoordelingen van botmonsters. Wat de histologische technieken betreft, hebben we ervoor gekozen om het botweefsel te ontkalken en vervolgens traditionele paraffine-inbedding uit te voeren. Samenvattend kan het combineren van deze twee methoden uitgebreidere en nauwkeurigere informatie opleveren over de microstructuur van botten.
Introduction
Osteoporose is een veel voorkomende metabole botziekte, vooral bij ouderen, en wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op fragiliteitsfracturen. Naarmate osteoporose vaker voorkomt in China1, zal er een groeiende vraag zijn naar het bestuderen van de botstructuren van kleine dieren 2,3. De vorige methoden voor het meten van botverlies zijn gebaseerd op de resultaten van tweedimensionale dual-energy röntgenabsorptiometrie. Dit legt echter niet de veranderingen in de architecturale microstructuur van het trabeculaire bot vast, wat een sleutelfactor is voor skeletsterkte4. De microstructuur van bot beïnvloedt de sterkte, stijfheid en breukbestendigheid. Door botmicroarchitectuur in normale en pathologische toestanden te vergelijken, kunnen veranderingen in de morfologie, structuur en functie van botweefsel veroorzaakt door osteoporose worden geïdentificeerd. Deze informatie draagt bij aan het begrip van de ontwikkeling van osteoporose en de associatie ervan met andere ziekten.
Microcomputertomografie (Micro-CT) beeldvorming is onlangs een populaire techniek geworden voor de beoordeling van botmorfologie, waar het nauwkeurige en uitgebreide gegevens kan opleveren over botstructuur- en dichtheidsparameters zoals botvolumefractie, dikte en scheiding 5,6. Tegelijkertijd kunnen de Micro-CT-resultaten worden beïnvloed door de analysesoftware7. Verschillende methoden voor beeldacquisitie, evaluatie en rapportage worden gebruikt door verschillende commerciële Micro-CT-systemen. Deze inconsistentie maakt het moeilijk om de resultaten van verschillende onderzoeken te vergelijken en te interpreteren5. Ook kan het momenteel geen bothistomorfometrie vervangen door onderzoekers informatie te verschaffen over parameters op cellulair niveau in het skelet8. Ondertussen maken histologische technieken directe observatie en meting van de microscopische morfologie van bot mogelijk. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE) is een veelgebruikte kleuringstechniek die in de histologie wordt gebruikt om de algemene structuur van cellen en weefsels te visualiseren. Het wordt gebruikt om de aanwezigheid van botweefsel en de microarchitectuur ervan te identificeren.
Dit artikel maakt gebruik van Micro-CT in combinatie met weefselsnijtechniek (Hematoxyline-Eosine [HE]-kleuring) om botweefselbeelden te verzamelen en kwantitatieve analyse van trabeculair bot uit te voeren om de veranderingen in de botmicrostructuur in een osteoporosemuismodel te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose kan leiden tot frequente fracturen, die kostbaar zijn, pijn, invaliditeit of zelfs de dood kunnen veroorzaken en de kwaliteit van leven van patiënten ernstig kunnen aantasten20. In de loop der jaren is het ovariëctomiemodel erkend als een van de standaardmethoden voor het bestuderen van osteoporose21. Het meest voorkomende preklinische diermodel voor osteoporose is de ovariëctomie (OVX) rat. Desondanks is het grootste deel van het onderzoek naar de mechanisme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) en het Graduate Research Innovation Project van de School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
