Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells को कुशल उत्पादन
Summary
यह प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल वेक्टर उत्पादन और murine टी सेल पारगमन को सुव्यवस्थित करता है, माउस CAR-T कोशिकाओं की कुशल पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले इंजीनियर सेल थेरेपी ने हेमटोलॉजिकल विकृतियों वाले व्यक्तियों में उल्लेखनीय प्रभावशीलता हासिल की है और वर्तमान में विविध ठोस ट्यूमर के उपचार के लिए विकास के दौर से गुजर रहे हैं। अब तक, उपन्यास CAR-T सेल उत्पादों का प्रारंभिक मूल्यांकन मुख्य रूप से इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों का उपयोग करके xenograft ट्यूमर मॉडल में हुआ है। इस दृष्टिकोण प्रयोगात्मक सेटिंग में मानव CAR-T कोशिकाओं के सफल engraftment की सुविधा के लिए चुना जाता है. हालांकि, सिनजेनिक माउस मॉडल, जिसमें ट्यूमर और सीएआर-टी कोशिकाएं एक ही माउस तनाव से प्राप्त होती हैं, एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली और व्यापक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के संदर्भ में नई सीएआर प्रौद्योगिकियों के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल पारगमन और पूर्व विवो टी सेल संस्कृति के लिए मानकीकृत तरीकों को पेश करके माउस CAR-T सेल पीढ़ी की प्रक्रिया को कारगर बनाने के उद्देश्य से है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को प्रतिरक्षा-सक्षम प्रणालियों में नई सीएआर प्रौद्योगिकियों के नियमित मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले लोगों से परे अन्य सीएआर निर्माणों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) को व्यक्त करने वाले दत्तक टी सेल थेरेपी ने विशेष रूप से एंटीजन-पॉजिटिवकैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने और खत्म करने के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की शक्ति का उपयोग करके कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। जबकि बी सेल दुर्दमताओं को लक्षित करने वाले सीएआर-टी सेल थेरेपी की सफलता को चिकित्सकीय रूप से मान्य किया गया है, पशु मॉडल में किए गए प्रीक्लिनिकल अध्ययन ठोस ट्यूमर को लक्षित करने वाले नए सीएआर के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, सीमित नैदानिक प्रभावकारिता ठोस ट्यूमर संकेत इस प्रकार अब तक में प्रदर्शन किया गया है, और यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि व्यक्तिगत preclinical मॉडल सही pharmacodynamics और एक जीवित दवा 2,3 की नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं करते. इसलिए, जांचकर्ताओं ने क्रमशः मानव और murine कैंसर के xenograft और syngeneic मॉडल में समानांतर आकलन शामिल करने के लिए CAR-T सेल उत्पादों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन का विस्तार करना शुरू कर दिया है।
ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल के विपरीत, जहां मानव ट्यूमर और टी कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में उकेरा जाता है, सिनजेनिक मॉडल एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के संदर्भ में सीएआर-टी सेल प्रतिक्रियाओं की परीक्षा को सक्षम करते हैं। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों असर syngeneic ट्यूमर दत्तक स्थानांतरित टी कोशिकाओं और संदर्भ-विशिष्ट milieus के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान – ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) और नियामक टी कोशिकाओं (Tregs) ट्यूमर microenvironment (टीएमई)4,5,6 में टी सेल समारोह को दबाने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, syngeneic मॉडल पर लक्ष्य का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त मंच की पेशकश, ऑफ-ट्यूमर विषाक्तता, और मेजबान कारकों है कि अतिरिक्त विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ CAR-T सेल बातचीत, साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम7 सहित.
इन फायदों के बावजूद, syngeneic CAR-T सेल अध्ययन की संख्या सीमित रहती है। विशेष रूप से, syngeneic मॉडल एक ही माउस तनाव से CAR-T कोशिकाओं के ऑटोलॉगस इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है और इस प्रकार कुशल murine टी सेल पारगमन और पूर्व vivo विस्तार 2,8 के लिए कार्यप्रणाली की कमी के कारण एक अतिरिक्त चुनौती पेश करते हैं. यह प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल वैक्टर के उत्पादन और अनुकूलित टी सेल पारगमन के माध्यम से स्थिर कार अभिव्यक्ति प्राप्त करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है। पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया गया है. इस दृष्टिकोण का उपयोग murine CAR-T कोशिकाओं के कुशल रेट्रोवायरल पारगमन और ultracentrifugation के माध्यम से वायरल एकाग्रता की आवश्यकता के बिना उच्च कार अभिव्यक्ति की उपलब्धि को दर्शाता है। सीएआर निर्माण की एंटीजन-विशिष्टता को बदलने के लिए रणनीतियों पर अतिरिक्त ट्रांसजीन की सह-अभिव्यक्ति के अलावा चर्चा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल विवो अध्ययनों में CAR-T कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए murine T कोशिकाओं के रेट्रोवायरल पारगमन के लिए आवश्यक चरणों और अभिकर्मकों का वर्णन करता है। रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन स्थितियों का अनु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए एल ब्रॉकमैन को धन्यवाद देते हैं। यह काम एनआईएच 1R01EB030352 और UL1 TR001873 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
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