Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T
Summary
Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.
Abstract
Terapias celulares projetadas utilizando células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) têm alcançado notável eficácia em indivíduos com neoplasias hematológicas e estão atualmente em desenvolvimento para o tratamento de diversos tumores sólidos. Até o momento, a avaliação preliminar de novos produtos de células CAR-T tem ocorrido predominantemente em modelos tumorais de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes. Esta abordagem é escolhida para facilitar o enxerto bem-sucedido de células CAR-T humanas no ambiente experimental. No entanto, modelos singênicos de camundongos, nos quais tumores e células CAR-T são derivados da mesma linhagem de camundongos, permitem a avaliação de novas tecnologias CAR no contexto de um sistema imunológico funcional e microambiente tumoral abrangente (TME). O protocolo aqui descrito visa agilizar o processo de geração de células CAR-T em camundongos, apresentando métodos padronizados para transdução retroviral e cultura ex vivo de células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outros construtos do CAR além dos utilizados neste estudo para permitir a avaliação rotineira de novas tecnologias do CAR em sistemas imunocompetentes.
Introduction
Terapias com células T que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) revolucionaram o campo da imunoterapia do câncer, aproveitando o poder do sistema imune adaptativo para atingir e eliminar especificamente células cancerosas antígeno-positivas1. Embora o sucesso das terapias com células CAR-T visando malignidades de células B tenha sido clinicamente validado, estudos pré-clínicos realizados em modelos animais permanecem vitais para o desenvolvimento de novos CARs direcionados a tumores sólidos. No entanto, a eficácia clínica limitada tem sido demonstrada em indicações de tumores sólidos até o momento, e está se tornando cada vez mais evidente que modelos pré-clínicos individuais não predizem com precisão a farmacodinâmica e a eficácia clínica de um medicamento vivo 2,3. Portanto, os pesquisadores começaram a expandir o estudo pré-clínico de produtos de células CAR-T para incluir avaliações paralelas em modelos de xenoenxerto e singênicos de cânceres humanos e murinos, respectivamente.
Ao contrário dos modelos de xenoenxerto, em que tumores humanos e células T são enxertadas em camundongos imunodeficientes, os modelos singênicos permitem o exame das respostas das células CAR-T no contexto de um sistema imunológico funcional. Especificamente, camundongos imunocompetentes portadores de tumores singênicos fornecem um sistema para estudar a interação entre células T transferidas adotivamente e meios contexto-específicos – incluindo macrófagos associados a tumores (TAMs) e células T reguladoras (Tregs) conhecidas por suprimir a função de células T no microambiente tumoral (TME)4,5,6. Além disso, os modelos singênicos oferecem uma plataforma adicional para avaliar a toxicidade no alvo, fora do tumor e a interação de células CAR-T com fatores do hospedeiro que podem levar a toxicidades adicionais, incluindo a síndrome de liberação de citocinas7.
Apesar dessas vantagens, o número de estudos singênicos com células CAR-T permanece limitado. Notadamente, modelos singênicos requerem engenharia autóloga de células CAR-T da mesma linhagem de camundongos e, portanto, apresentam um desafio adicional devido à falta de metodologia para transdução eficiente de células T murinas e expansão ex vivo 2,8. Este protocolo descreve os métodos para alcançar a expressão estável do CAR através da produção de vetores retrovirais e transdução otimizada de células T. Um esquema de todo o processo é mostrado na Figura 1. O uso desta abordagem demonstra a transdução retroviral eficiente de células CAR-T murinas e a obtenção de alta expressão de CAR sem a necessidade de concentração viral através da ultracentrifugação. Estratégias para alterar a antigenespecificidade do construto CAR são discutidas, além da co-expressão de transgenes adicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve as etapas e reagentes necessários para a transdução retroviral de células T murinas para gerar células CAR-T para estudos in vivo . A otimização das condições de transdução retroviral alcança uma expressão robusta de CAR sem a necessidade de concentração viral por ultracentrifugação ou reagentes adicionais. No entanto, há múltiplas modificações que podem ser aplicadas a essa metodologia.
Enquanto este protocolo descreve a geração de exemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a L. Brockmann pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NIH 1R01EB030352 e UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
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