Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken
Summary
Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.
Abstract
Astrocyten en microglia spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, letselreacties en neurodegeneratieve ziekten. Deze zeer dynamische cellen vertonen snelle reacties op veranderingen in de omgeving en vertonen een aanzienlijke heterogeniteit in termen van morfologie, transcriptieprofielen en functies. Hoewel ons begrip van de functies van gliacellen bij gezondheid en ziekte aanzienlijk is verbeterd, blijft er behoefte aan in vitro, celspecifieke analyses die worden uitgevoerd in de context van beledigingen of verwondingen om verschillende celpopulaties volledig te karakteriseren. Het isoleren van cellen van de volwassen muis biedt verschillende voordelen ten opzichte van cellijnen of neonatale dieren, omdat het de analyse van cellen onder pathologische omstandigheden en op specifieke tijdstippen mogelijk maakt. Bovendien maakt de focus op ruggenmergspecifieke isolatie, met uitzondering van betrokkenheid van de hersenen, onderzoek mogelijk naar ruggenmergpathologieën, waaronder experimentele auto-immuunencefalomyelitis, ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor het isoleren van astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor onmiddellijke of toekomstige analyse wordt vergemakkelijkt met mogelijke toepassingen in functionele, moleculaire of proteomische stroomafwaartse studies.
Introduction
Astrocyten en microglia zijn veelzijdige gliacellen die een vitale rol spelen in het centrale zenuwstelsel (CZS), met verantwoordelijkheden zoals het reguleren van de neuronale functie, het bijdragen aan de ontwikkeling van het CZS, het onderhouden van de bloed-hersenbarrière en het deelnemen aan andere kritieke processen 1,2,3,4 . Naast hun rol bij het handhaven van de homeostase, spelen deze gliacellen ook een cruciale rol bij letsel- en herstelmechanismen. Microglia staan bekend om hun fagocytische, inflammatoire en migrerende eigenschappen na beledigingen of verwondingen 5,6,7. Astrocytenreacties bij ziekte zijn even divers en omvatten bijdragen aan ontstekingen, de vorming van glialittekens en het aantasten van de bloed-hersenbarrière 8,9. Hoewel ons begrip van de schadelijke en herstellende rol van microglia en astrocyten in het CZS is gegroeid, vereist de inherente heterogeniteit in zowel hun structuur als functie robuuste instrumenten om ze in verschillende contexten te bestuderen.
Om meer inzicht te krijgen in de rol van microglia en astrocyten in gezondheid en ziekte, is een gecombineerde aanpak van in vivo en in vitro onderzoek nodig. In vivo technieken maken gebruik van de ingewikkelde overspraak tussen gliacellen en neuronen in het CZS, terwijl in vitro methodologieën waardevol blijken te zijn bij het beoordelen van eencellige functies of reacties onder specifieke stimuli. Elke methode biedt unieke voordelen; In vitro studies zijn essentieel voor het begrijpen van de specifieke rollen van deze celtypen zonder directe of indirecte input van naburige cellen. Bovendien bieden in-vitrotests die gebruik maken van onsterfelijke cellijnen bepaalde voordelen, waaronder het vermogen om zich voor onbepaalde tijd te vermenigvuldigen, kostenefficiëntie en onderhoudsgemak. Het is echter belangrijk op te merken dat primaire cellen normale fysiologische reacties beter nabootsen in vergelijking met cellijnen. Deze fysiologische relevantie is cruciaal in functionele assays en transcriptomische analyses.
Een van de uitdagingen bij het verkrijgen van primaire cellen, met name uit het ruggenmerg van volwassen muizen, ligt in de hoeveelheid en levensvatbaarheid van de monsters. Het volwassen ruggenmerg, dat kleiner is dan de hersenen en een aanzienlijke hoeveelheid myeline bevat, vormt unieke moeilijkheden. Hoewel er verschillende gepubliceerde protocollen zijn die de isolatie van zuivere, levensvatbare gliacellen van neonatale dieren of de hersenen van volwassen muizen beschrijven 10,11,12,13, zijn deze methodologieën mogelijk niet geschikt voor het bestuderen van ziekten en verwondingen die specifiek zijn voor het ruggenmerg. In dit protocol bieden we een uitgebreide procedure om zuivere, levensvatbare microglia en astrocyten efficiënt te isoleren uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor stroomafwaartse toepassingen in celkweek en transcriptomische analyses worden vergemakkelijkt. Dit protocol is met succes gebruikt om deze cellen te isoleren van volwassen muizen in de leeftijd van 10 weken tot 5 maanden, wat het nut ervan in verschillende contexten aantoont, waaronder onderzoeken met voorwaardelijke knock-outmuizen, geneesmiddelreacties, ontwikkelingsonderzoek en leeftijdsgerelateerde modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het isoleren van zuivere, levensvatbare primaire cellen is van het grootste belang voor het onderzoeken van de structuur en functie van specifieke celtypen. Bij de volwassen muis, met name in het ruggenmerg, brengt deze taak aanzienlijke uitdagingen met zich mee, omdat bestaande protocollen vaak niet zijn afgestemd op het volwassen ruggenmerg10,17. Dit protocol biedt een efficiënte en kosteneffectieve methode die van toepassing is op verschillende stroomafwaarts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Castle Raley van de George Washington University Genomics Core voor RNA-analyses en Q2 Lab Solutions voor RNA-sequencing-analyses. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke [subsidienummer F31NS117085] en de Vivian Gill Research Endowment aan Dr. Robert H. Miller. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
