ここでは、振幅変調電極形成アプローチを使用したヒト赤血球の場合の機械的疲労試験のプロトコルを示します。この一般的なアプローチは、周期的変形からの懸濁液中の生物学的細胞の形態学的および生体力学的特性の系統的変化を測定するために使用することができる。
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この記事について
サマリー
要約
赤血球(RBC)は、その顕著な変形能力で知られています。それらは微小循環を通過するときに繰り返しかなりの変形を受ける。変形能の低下は、生理学的に老化した赤血球で見られます。 細胞の変形能を測定する既存の技術は、周期的な負荷によって引き起こされる細胞膜の段階的な劣化である疲労の測定に容易に使用することはできません。マイクロ流体チャネルにおける振幅シフトキーイング(ASK)変調ベースの電極形成を使用して、周期的せん断応力による赤血球の機械的劣化を評価するためのプロトコルを提示します。簡単に説明すると、マイクロ流体チャネル内のインタージテッド電極は、信号発生器を使用して無線周波数で低電圧交流で励起される。浮遊中の赤血球は電界に反応し、細胞を電極の端に移動する正の誘電泳動(DEP)を示します。次に、2つのセルの半分にかかる電気力によりセルが引き伸ばされ、電着として知られる一軸延伸が発生します。せん断応力のレベルと結果として生じる変形は、励起波の振幅を変更することで簡単に調整できます。これにより、大小の変形に応じた赤血球の非線形変形能を高スループットで定量化できます。ASK法で励起波を変更すると、プログラム可能な負荷率と周波数で周期的な電極形成が誘導されます。これは、RBC疲労の特性評価に便利な方法を提供します。当社のASK変調電極形成アプローチにより、初めて、繰返し荷重からのRBC疲労の直接測定が可能になりました。一般的な生体力学的試験、他の細胞型や疾患状態における細胞の変形能や疲労の分析のためのツールとして使用でき、酸素圧や生物学的および化学的手がかりなどの細胞の微小環境を制御するための戦略と組み合わせることもできます。
概要
赤血球(RBC)は、人体で最も変形しやすい細胞です1。それらの変形能力はそれらの酸素運搬機能に直接関係している。赤血球の変形能の低下は、いくつかの赤血球障害の病因と相関することがわかっています2。変形能の測定により、赤血球関連疾患の理解が深まりました3。赤血球の通常の寿命は、70〜140日目4までさまざまです。したがって、それらの変形能力が時効プロセスとともにどのように低下するか、例えば、周期せん断応力による疲労挙動を測定することが重要です3。
ハイスループットでの赤血球変形能の測定は、個々の細胞にピコニュートンスケール力(~10-12 N)がかかるため、困難です。過去10年間で、細胞の変形能を測定するために多くの技術が開発されてきました5。単一細胞レベルでの赤血球の変形測定はピペット吸引と光ピンセットで、バルク分析は浸透圧勾配エクタサイトメトリーで行うことができます。エクタサイトメトリー分析は豊富なデータを提供し、血液疾患を診断する機会を提供します6,7....
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プロトコル
非同定化されたヒト全血が商業的に得られた。血液サンプルを含む作業は、フロリダアトランティック大学の機関バイオセーフティ委員会によって承認されたプロトコルを利用して、バイオセーフティレベル2の実験室で実施されました。
1. マイクロ流体デバイスの作製
- マイクロ流体チャネル設計用のSU-8マスターシリコンウェーハをプラスチック製の14cmペトリ皿の内側にテープで留め、N2 ガスで洗浄します。
- 紙コップにポリジメチルシロキサン(PDMS)ベース60gとPDMS硬化剤6gの重量を量ります。混合物が曇った白色になるまで、木のへらを使用して2つの部分を混合します。
- PDMS混合物をシリコンウェーハを含むプラスチックペトリ皿に注ぎます。ペトリ皿を3方向活栓付きの真空デシケーターに入れます。活栓のバルブを回して真空をデシケータ室に接続し、PDMSから気泡を取り除きます。
- 約5分サイクルでデシケーターチャンバーを周囲に接続するように活栓バルブを調整して、デシケーターチャンバーに空気を再導入します。すべての気泡がチャネルの機能から除去されるまで繰り返します。
- ペトリ皿を70°Cのオーブンに4時間入れます。時間が経過したら、ペトリ皿を取り出し、室温まで冷まして、カッティングマットの上に置きます。
- メスを使用して、シリコンウェ....
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結果
細胞懸濁液をマイクロ流体チャネルに装填すると、細胞の比較的均一な分布が観察された。関数発生器からの信号出力(単純な正弦波やASKのオンキーイング位相など)を行うと、薄膜のインターディジット電極は不均一な交流電界を生成しました。浮遊セルはこの電気的励起に自発的に応答し、正のDEP挙動、すなわちより高い電界強度を有する電極の端に向かって移動した。その結果、セルは電極の縁に沿って整列し、電極形成のために引き伸ばされました。オンキーイングフェーズでは、電極形成によりRBCが引き伸ばされます。オフキーイングフェーズでは、RBCは緩和されます(図5B)。このプロトコルでは、細胞の離散性を維持することが重要です。このプロトコルに記載されている希釈係数を使用して、正常な赤血球の細胞懸濁液は62〜104細胞/μLの範囲であった。この範囲内の濃度で、正のDEP効果による細胞の蓄積を最小限に抑えながら、細胞測定のハイスループットを得ることができました。
1時間の疲労試験中に個々の赤血球を追跡したところ、細胞の変形が徐々に減少することが観察されま.......
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ディスカッション
DEP力を誘導する正弦波のASK OOK変調を使用して、長期間にわたる赤血球の機械的疲労をテストできます。このプロトコルでは、細胞変形能に対する潜在的な代謝への悪影響を防ぐために、in vitro疲労試験を1時間に制限しました。包括的な疲労試験条件は、ASK変調電極形成技術を使用してプログラムできます。負荷周波数、振幅、負荷率などのパラメータはすべてプログラムできます。荷重周波数は、荷重周波数に対する疲労の依存性、および繰返し荷重と静的荷重の違いを決定するために、さまざまな値にプログラムできます13。
伸縮の大きさは、小さな変形または大きな変形に対して異なる電圧レベルを使用して簡単に調整できます。ただし、大きな変形を含む高電圧レベルを使用する場合、電着は炎のような形状のRBCをもたらすことに注意してください(図6、ステップ3)。これにより、セルの形状に楕円を合わせるときにエラーが発生し、セルの尖ったエッジが切り取られる可能性があります。この状況下で、特に電極形成を使用して膜せ.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、ヘモグロビンベースの人工酸素キャリアのNSF / CMMIメカノバイオロジー(#1941655)および健康および病気の赤血球のNSF / CMMI動的および疲労分析(#1635312)によって資金提供されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| テンプスケール | ViBRA | HT-224R | |
| バンドパスフィルター | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Luer-Lok&tradeの使い捨て注射器;ヒント、1 mL | フィッシャー サイエンティフィ | 14-823-30 | |
| 生検パンチ プランジャー システム付き、1.5 mm | フィッシャー サイエンティフィック | 12-460-403 | |
| 生検パンチ プランジャー システム付き、3 mm | フィッシャー サイエンティフィック | 12-460-407 | 直径 1.5 mm および 3 mm |
| 鈍い針、23 ゲージ | BSTAN | X001308N97 | |
| ボビン血清アルブミン | RMBIO | BSA-BSH | |
| 遠心分離機 | SCILOGEX | 911015119999 | |
| コニカルチューブ、50 mL | フィッシャーサイエンティフィック | 05-539-13 | |
| デキストロース | フィッシャーサイエンティフィ | ック MDX01455 | ミリポアシグマ™ |
| EC低導電率計 | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf スナップキャップ式超小型遠心チューブ | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | グラフプロット | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| ガラス/ITO電極基板 | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 倒立顕微鏡 | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | デジタルモデル |
| Matlab | MathWorks | グラフプロット | |
| マイクロ浸透圧計 - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S / N:03050397P | |
| パラフィルムラボラッピングフィルム | フィッシャーサイエンティフィック | 13-374-12 | |
| シャーレ | FALCON | SKU = 351006 | ICSI /Biopsydish 50 * 9 mm |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| プラズマクリーナーハ | リックプラズマPDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | ダッソーシステムズ | CADソフトウェア | |
| ショ糖 | フィッシャーサイエンティフィック | 50-188-2419 | |
| 真空デシケーター | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| 木製ヘラ | フィッシャーサイエンティフィ | NC0304136 | 舌圧子 ウッド NS 6インチ |
参考文献
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al.
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再版と許可
