Her er en protokol til dyrkning af placentaplanter under konstante strømningsforhold. Denne tilgang forbedrer traditionelle statiske villøse kultursystemer ved at muliggøre replikation af dynamiske fysiologiske miljøer.
De eksisterende ex vivo placenta-eksplantatkulturmodeller er primært baseret på statiske kultursystemer ved hjælp af brøndplader. Disse modeller afspejler imidlertid ikke tilstrækkeligt dynamikken i livmoderen , hvor moderkagen møder konstant let forskydningsstress på grund af plasma eller blodgennemstrømning. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet et flowkultursystem for at bringe ex vivo placenta-eksplantatdyrkning tættere på de in utero-strømningsforhold , der opleves i moderkroppen. Inden for denne tilgang dyrkes placentaeksplanter i en sekvens af fem sammenkoblede strømningskamre. Denne indstilling opretholder fysiologiske iltkoncentrationer og en ensartet strømningshastighed. De indsamlede data afslører, at bevarelsen af vævsmorfologi under strømningsbetingelser udviser bemærkelsesværdig forbedring sammenlignet med konventionelle statiske metoder. Denne innovative teknik introducerer et enkelt middel til ex vivo placenta explant-kultur, der giver en mere tro repræsentation af det dynamiske in vivo-miljø . Desuden introducerer denne undersøgelse nye muligheder for at undersøge den funktionelle dynamik i føto-moderens grænseflade. Ved at omfavne gennemførlige dynamiske metoder lettes en dybere forståelse af placenta biologi, hvilket understreger dens relevans for moder-føtal sundhed.
Siden 1960’erne er placenta explant dyrkning på bunden af en brøndplade blevet brugt til at studere føto-moderens grænseflade 1,2,3. Denne metode er veletableret og ligetil og muliggør udnyttelse af humant væv til forskellige undersøgelser ud over kulturer af enkeltceller 2,3. Over tid er eksperimentelle designs til placenta-eksplantatkulturer blevet ændret med hensyn til iltkoncentration4 og for at forhindre vævet i at sætte sig i brøndpladens bund 2,5,6. Denne metode er imidlertid ikke blevet tilpasset in vivo-forholdene i livmoderen, specifikt tilstedeværelsen af en konstant strøm3.
Succesen med en graviditet afhænger af en tilstrækkelig og konsekvent perfusion af det intervilløse rum med moderens blod, der etablerer et dynamisk kredsløb med kontinuerlig tilstrømning og udstrømning af blod og blodbårne stoffer 7,8,9,10,11,12. Placenta har to forskellige blodforsyningssystemer, et til moderblod og et til føtalt blod, hvilket resulterer i dobbelt perfusion af både føtal og modersystem13. Moderens blod begynder at perfusere moderkagens intervilløse rum i slutningen af første trimester og strømmer langsomt gennem udvidede livmoderspiralarterier10,11,14. Derfor bades placenta villøse træer i moderblod og leverer næringsstoffer og ilt til fosteret. Dette moderblod strømmer gennem det intervilløse rum, før det vender tilbage til moderens cirkulation via uteroplacentale vener. Under sin passage gennem det intervilløse rum fører diffusion og aktiv optagelse af ilt og næringsstoffer i fosterblod til lavere ilt- og næringsstofniveauer i moderblod12,15. Imidlertid erstattes det intervilløse rums blod fuldstændigt af frisk, iltrigt blod cirka to til tre gange i minuttet, hvilket sikrer en kontinuerlig forsyning af næringsstoffer og gasser13. Især syncytiotrophoblast, den yderste del af placentabarrieren, er den eneste komponent i placenta villøse træ, der direkte udsættes for moderblod15,16,17. Derfor oplever syncytiotrophoblast en konstant mild forskydningsspænding fra det flydende moderblod 3,14.
Den nuværende videnskabelige viden om placenta flow miljøet og moderne tekniske fremskridt tillader nu en tilpasset og fysiologisk tilnærmet dyrkning af placenta explants under strømningsbetingelser. Desuden tyder beviser på, at forskydningskræfter påvirker de biologiske funktioner af syncytiotrophoblast 18,19,20,21. En velkendt tilgang, der tegner sig for blodgennemstrømningen, er placenta dual lobe perfusionssystem22. Disse eksperimenter kræver imidlertid betydelig ekspertise, er tidsbegrænsede (udføres kun i nogle få timer) og er kun mulige med placentaprøveri tredje trimester 3,23. I modsætning hertil har vi udviklet en ligetil og ikke-påtrængende teknik til ex vivo placenta villøs eksplantatkultur under konstante strømningsindstillinger, der imødekommer både første og tredje trimester placentavæv3. I denne opsætning dyrkes placentaeksplanter i fem serieforbundne flowkamre. Villøse eksplanter fastgøres til kammerets bund ved hjælp af nåleformede forhøjninger på tynde metalplader. Det konstruerede flowkredsløb overføres efterfølgende til en bioreaktor, hvor både iltkoncentration og strømningshastighed reguleres3. Flowkulturresultater viser, at vævsintegriteten bevares bedre sammenlignet med den typisk anvendte statiske metode3. Desuden muliggør denne dynamiske tilgang nye og tilpassede eksperimentelle designs til vævseksplantedyrkning, hvilket muliggør in vitro-forsøg, der i højere grad efterligner det naturlige miljø3.
Denne undersøgelse introducerer et unikt perspektiv på en flowkulturteknik til placentaeksplanter designet til at replikere dynamikken i utero-miljøet 3,23. Resultaterne afslører, at morfologien af væv dyrket under strømningsbetingelser er bedre bevaret sammenlignet med den traditionelle statiske dyrkningsmetode3. Især selvom hverken statiske eller strømningskulturbetingelser letter perfusion af placentakar, blev ødelæggelsen af føto-placenta blodkar inde i villøs stroma overvejende observeret i statisk kultur, mens blodkarrenes integritet syntes at være bedre opretholdt over en længere varighed i flowkultur3.
En mulig forklaring på denne observation kunne være knyttet til den afgørende beskyttende og endokrine rolle af syncytiotrophoblast, en funktion veldokumenteret i litteraturen 12,24,25,26. I betragtning af dette er det tænkeligt, at den overordnede integritet af det ydre lag af villi væsentligt bidrager til vedligeholdelsen af den underliggende stroma, herunder blodkarrene. Derfor kan blodkarrenes vedvarende cellulære integritet under strømningsbetingelser tilskrives den kontinuerlige strøm af mediet. Denne bevægelse hjælper med den passive bevægelse af eksplanterne, hvilket letter udvekslingen af gasser, næringsstoffer og nanopartikler (som ekstracellulære vesikler) over placentabarrieren. Dette kan igen have en positiv indvirkning på bevarelsen af blodkarmorfologi. Desuden spiller fænomenet mekanosensation en rolle i vævsmorfogenese på tværs af forskellige væv27,28. Undersøgelser har vist, at mekanositfølsomhed påvirker cellulære processer på flere niveauer, hvilket udløser en række biokemiske reaktioner, der i sidste ende påvirker vævs- og organfunktionalitet29. Især udtrykkes mekanofølsomme proteiner af syncytiotrophoblast gennem hele drægtigheden28. Desuden antyder undersøgelsen, at mikrovilli på vævsoverfladen kan være impliceret i denne sammenhæng28.
Et yderligere perspektiv, der er værd at overveje, er mitokondriernes potentielle rolle i det cellulære respons på strømning. For eksempel tjener mitokondrier i endotelceller som signaltransducere til cellulære reaktioner på miljømæssige stimuli30. Øget akkumulering af lipiddråber, observeret i statisk dyrket væv gennem TEM3, har været forbundet med apoptoseinduktion på grund af mitokondriel dysfunktion31. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afdække de underliggende mekanismer og nøglefaktorer, der forbinder dem med nedstrøms signalveje. Denne udforskning kan forbedre vores forståelse af, hvordan vævet opfatter og reagerer på forskydningsstress, hvilket oversættes til forbedret levedygtighed og integritet af villøse eksplanter i kultur23.
Flere kritiske protokoltrin skal gentages og udføres med omhu. Efter placenta levering skal væv dyrkes så hurtigt som muligt. Under forberedelse af eksplantater er det afgørende at undgå områder med synlige infarkter. Det er vigtigt at håndtere eksplanter forsigtigt med tang for at forhindre klemning. Det anbefales at holde vævet dækket med væske under hele proceduren og udføre det hurtigt.
Det er vigtigt at erkende, at denne undersøgelse ikke er i stand til at specificere den nøjagtige forskydningsspænding inden for det præsenterede flowsystem, hvilket bør betragtes som en begrænsning i fremtidige undersøgelser 3,23. Ikke desto mindre er det vigtigt at erkende, at præcis strømningshastighed og forskydningsspænding for en bestemt placenta villus in vivo påvirkes af adskillige parametre, såsom de geometriske egenskaber ved det intervilløse rum, villusens placering inden for dette rum og dets nærhed og vinkel til moderens spiralarterier og livmodervener 3,19,23,32 . Kompleksiteten af moderkagens geometriske struktur, som varierer mellem individer, skal også tages i betragtning23,32. Der findes allerede matematiske modeller, der estimerer blodgennemstrømningen i det intervilløse rum32 og beregninger af vægforskydningsspænding på syncytiotrophoblast19,28. Interessant nok forudsagde en undersøgelse, at forskydningsspænding på syncytiotrophoblast er lavere i tredje trimester sammenlignet med første trimester28, mens en anden demonstrerede rumligt heterogen vægforskydningsspænding på syncytiotrophoblast19. Bestemmelse af den præcise strømningshastighed og forskydningsspænding for en bestemt placenta villus forbliver en udfordring 3,19,23,32. Sådanne beregninger giver en tilnærmelse af forskydningsspændingsområdet til fremtidige undersøgelser, men de kan kræve løbende anatomiske justeringer og optimering23. Desuden kan fremtidige undersøgelser udvikle nye og raffinerede gennemstrømningskulturteknikker, der tager højde for den indviklede geometri i det intervilløse rum og strategier til at øge antallet af prøver pr. Eksperiment3. Der forventes løbende fremskridt og udvikling af flowsystemet, potentielt anvendelse af alternative flowkamre (Brugger et al., upublicerede data, 2023).
Afslutningsvis lægger denne undersøgelse et robust fundament ved at demonstrere en let implementerbar ex vivo flowkulturteknik, der opretholder den strukturelle integritet af dyrkede villøse eksplanter. Det understreger betydningen af dynamiske teknikker i placenta funktionelle biologistudier, hvilket baner vejen for yderligere fremskridt inden for flowkultursystemer og generering af nye ideer og hypoteser 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne sætter stor pris på den fremragende tekniske støtte fra Bettina Amtmann og Petra Winkler til vævsprøvetagning. Denne forskning blev finansieret af den østrigske videnskabsfond FWF (DOC 31-B26) og det medicinske universitet i Graz, Østrig, gennem ph.d.-programmet Inflammatoriske lidelser under graviditet (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |