Rekonstruktion af blod-hjerne-barrieren in vitro til modellering og terapeutisk målretning af neurologisk sygdom

Summary

Blod-hjerne-barrieren (BBB) spiller en afgørende rolle for at opretholde et stabilt og sundt hjernemiljø. BBB dysfunktion er forbundet med mange neurologiske sygdomme. Vi har udviklet en 3D, stamcelleafledt model af BBB for at undersøge cerebrovaskulær patologi, BBB-integritet, og hvordan BBB ændres af genetik og sygdom.

Abstract

Blod-hjerne-barrieren (BBB) er en vigtig fysiologisk komponent i centralnervesystemet (CNS), opretholder næringsstoffer, rydder affald og beskytter hjernen mod patogener. BBB’s iboende barriereegenskaber udgør en udfordring for terapeutisk lægemiddellevering til CNS til behandling af neurologiske sygdomme. Nedsat BBB-funktion har været relateret til neurologisk sygdom. Cerebral amyloid angiopati (CAA), aflejring af amyloid i cerebral vaskulatur, der fører til en kompromitteret BBB, er en co-morbiditet i de fleste tilfælde af Alzheimers sygdom (AD), hvilket tyder på, at BBB dysfunktion eller nedbrydning kan være involveret i neurodegeneration. På grund af begrænset adgang til humant BBB-væv forbliver de mekanismer, der bidrager til korrekt BBB-funktion og BBB-degeneration, ukendte. For at løse disse begrænsninger har vi udviklet en human pluripotent stamcelleafledt BBB (iBBB) ved at inkorporere endotelceller, pericytter og astrocytter i en 3D-matrix. iBBB samler sig selv for at rekapitulere anatomien og cellulære interaktioner, der findes i BBB. Såning af iBBB’er med amyloid fanger nøgleaspekter af CAA. Derudover tilbyder iBBB en fleksibel platform til at modulere genetiske og miljømæssige faktorer, der er involveret i cerebrovaskulær sygdom og neurodegeneration, for at undersøge, hvordan genetik og livsstil påvirker sygdomsrisikoen. Endelig kan iBBB bruges til lægemiddelscreening og medicinalkemiske undersøgelser for at optimere terapeutisk levering til CNS. I denne protokol beskriver vi differentieringen af de tre typer celler (endotelceller, pericytter og astrocytter), der stammer fra humane pluripotente stamceller, hvordan man samler de differentierede celler i iBBB, og hvordan man modellerer CAA in vitro ved hjælp af eksogent amyloid. Denne model overvinder udfordringen med at studere levende menneskeligt hjernevæv med et system, der har både biologisk troskab og eksperimentel fleksibilitet, og muliggør forhør af den menneskelige BBB og dens rolle i neurodegeneration.

Introduction

Blod-hjerne-barrieren (BBB) er et vigtigt mikrovaskulært netværk, der adskiller centralnervesystemet (CNS) fra periferien for at opretholde et ideelt miljø for korrekt neuronal funktion. Det har en kritisk rolle i reguleringen af tilstrømning og udstrømning af stoffer til CNS ved at opretholde metabolisk homeostase 1,2,3,4, rydde affald ^4,5,6 og beskytte hjernen mod patogener og toksiner ^7,8.

Den primære celletype af BBB er endotelcellen (EC). Endotelceller, der stammer fra mesoderm-slægten, danner væggene i vaskulaturen ^1,9. Mikrovaskulære EC’er danner tætte kryds med hinanden for i høj grad at reducere permeabiliteten af deres membran 10,11,12,13,14, mens de udtrykker transportører for at lette bevægelsen af næringsstoffer ind og ud af CNS 1,4,12,14 . Mikrovaskulære EC’er er omgivet af pericytter (PC’er)-vægmalerier, der regulerer mikrovaskulær funktion og homeostase og er kritiske for regulering af BBB’s permeabilitet for molekyler og immunceller 15,16,17. Astrocytten, en vigtig gliacelletype, er den endelige celletype, der omfatter BBB. Astrocyte endefødder vikles rundt om EC-PC-vaskulærrørene, mens cellelegemerne strækker sig ind i hjernens parenchyma og danner en forbindelse mellem neuroner og vaskulatur¹. Forskellige opløste stoffer og substrattransportører er lokaliseret på astrocytendefødder (f.eks. aquaporin 4 [AQP-4]), der har en kritisk rolle i BBB-funktion 18,19,20,21.

BBB er afgørende for at opretholde korrekt hjernesundhedsfunktion, og dysfunktion af BBB er blevet rapporteret i mange neurologiske sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD) 22,23,24,25, multipel sklerose 7,26,27,28, epilepsi ^29,30 og slagtilfælde^31,32. Det anerkendes i stigende grad, at cerebrovaskulære abnormiteter spiller en central rolle i neurodegeneration, hvilket bidrager til øget modtagelighed for iskæmiske og hæmoragiske hændelser. For eksempel har mere end 90% af AD-patienter cerebral amyloid angiopati (CAA), en tilstand karakteriseret ved aflejring af amyloid β (Aβ) langs cerebral vaskulatur. CAA øger BBB-permeabiliteten og nedsætter BBB-funktionen, hvilket efterlader CNS sårbar over for iskæmi, hæmoragiske hændelser og accelereret kognitiv tilbagegang³³.

Vi har for nylig udviklet en in vitro-model af den humane BBB, afledt af patientinducerede pluripotente stamceller, som inkorporerer EC’er, PC’er og astrocytter indkapslet i en 3D-matrix (figur 1A). iBBB rekapitulerer fysiologisk relevante interaktioner, herunder vaskulær rørdannelse og lokalisering af astrocytendefødder med vaskulatur²⁴. Vi anvendte iBBB til at modellere følsomheden af CAA medieret af APOE4 (figur 1B). Dette gjorde det muligt for os at identificere de kausale cellulære og molekylære mekanismer, hvormed APOE4 fremmer CAA, og udnytte disse indsigter til at udvikle terapeutiske strategier, der reducerer CAA-patologi og forbedrer læring og hukommelse in vivo hos APOE4-mus²⁴. Her giver vi en detaljeret protokol og videovejledning til rekonstruktion af BBB fra humane iPSC’er og modellering af CAA in vitro.

Protocol

1. Differentiering af iPSC’er i iBBB-celler BEMÆRK: Disse differentieringsprotokoller er tidligere beskrevet i Mesentier-Louro et al.34. Belægning af cellekulturpladerOptøning af membranmatrix med reduceret vækstfaktor (GF) natten over ved 4 °C. Fortynd 500 μL kældermembranmatrix i 49,5 ml DMEM. Hold denne opløsning kold for at forhindre for tidlig polymerisation af belægningsopløsningen. Tilsæt 1-2 ml pr. hul af…

Representative Results

En korrekt formet iBBB størkner til en enkelt gennemskinnelig skive (figur 3A). Det er normalt, at iBBB løsner sig fra overfladen, hvorpå den først blev pipetteret efter et par dage. Dette kan ikke undgås, men er ikke et stort problem for den korrekte dannelse af iBBB, hvis man er forsigtig, når man skifter medie for ikke ved et uheld at aspirere iBBB. Efter 24 timer, jævnt fordelt, kan enkeltceller identificeres under et brightfield-mikroskop (figur 3B)….

Discussion

BBB dysfunktion er en co-morbiditet, og potentielt en årsag eller forværrende faktor i talrige neurologiske sygdomme ^7,40,41. Det er imidlertid næsten umuligt at studere molekylær- og cellebiologien, der ligger til grund for dysfunktion og nedbrydning af BBB hos mennesker med neurovaskulær sygdom. Den inducerbare-BBB (iBBB), der præsenteres i denne protokol, tilvejebringer et in vitro-system, der rekapitulerer vig…

Materials

6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500