JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Reconstruction de la barrière hémato-encéphalique in vitro pour modéliser et cibler thérapeutiquement les maladies neurologiques

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

La barrière hémato-encéphalique joue un rôle crucial dans le maintien d’un environnement cérébral stable et sain. Le dysfonctionnement de la BHE est associé à de nombreuses maladies neurologiques. Nous avons développé un modèle 3D dérivé de cellules souches de la BHE pour étudier la pathologie cérébrovasculaire, l’intégrité de la BHE et la façon dont la BHE est modifiée par la génétique et la maladie.

Abstract

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un élément physiologique clé du système nerveux central (SNC), qui maintient les nutriments, élimine les déchets et protège le cerveau des agents pathogènes. Les propriétés barrières inhérentes à la BHE posent un défi pour l’administration de médicaments thérapeutiques dans le SNC pour traiter les maladies neurologiques. L’altération de la fonction BHE a été associée à une maladie neurologique. L’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), le dépôt d’amyloïde dans le système vasculaire cérébral conduisant à une BHE compromise, est une comorbidité dans la plupart des cas de maladie d’Alzheimer (MA), ce qui suggère que le dysfonctionnement ou la dégradation de la BHE peut être impliqué dans la neurodégénérescence. En raison de l’accès limité aux tissus de la BHE humaine, les mécanismes qui contribuent au bon fonctionnement de la BHE et à la dégénérescence de la BHE demeurent inconnus. Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point une BHE dérivée de cellules souches pluripotentes humaines (iBBB) en incorporant des cellules endothéliales, des péricytes et des astrocytes dans une matrice 3D. L’iBBB s’auto-assemble pour récapituler l’anatomie et les interactions cellulaires présentes dans la BHE. L’ensemencement des iBBB avec de l’amyloïde capture les aspects clés de l’ACA. De plus, l’iBBB offre une plate-forme flexible pour moduler les facteurs génétiques et environnementaux impliqués dans les maladies cérébrovasculaires et la neurodégénérescence, afin d’étudier comment la génétique et le mode de vie affectent le risque de maladie. Enfin, l’iBBB peut être utilisé pour le criblage de médicaments et les études de chimie médicinale afin d’optimiser l’administration thérapeutique au SNC. Dans ce protocole, nous décrivons la différenciation des trois types de cellules (cellules endothéliales, péricytes et astrocytes) issues de cellules souches pluripotentes humaines, comment assembler les cellules différenciées dans l’iBBB, et comment modéliser l’AAC in vitro à l’aide de l’amyloïde exogène. Ce modèle permet de relever le défi d’étudier les tissus cérébraux humains vivants avec un système qui a à la fois une fidélité biologique et une flexibilité expérimentale, et permet d’interroger la BHE humaine et son rôle dans la neurodégénérescence.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un réseau microvasculaire clé qui sépare le système nerveux central (SNC) de la périphérie afin de maintenir un environnement idéal pour le bon fonctionnement neuronal. Il joue un rôle essentiel dans la régulation de l’afflux et de l’efflux de substances dans le SNCen maintenant l’homéostasie métabolique 1,2,3,4, en éliminant les déchets 4,5,6 et en protégeant le cerveau des agents pathogènes et des toxines 7,8.

Le principal type de cellule de la BHE est la cellule endothéliale (CE). Les cellules endothéliales, issues de la lignée du mésoderme, forment les parois du système vasculaire 1,9. Les CE microvasculaires forment des jonctions serrées les unes avec les autres pour réduire considérablement la perméabilité de leur membrane 10,11,12,13,14 tout en exprimant des transporteurs pour faciliter le mouvement des nutriments dans et hors du SNC 1,4,12,14 . Les CE microvasculaires sont entourées de cellules péricytaires (PC) murales qui régulent la fonction microvasculaire et l’homéostasie et sont essentielles à la régulation de la perméabilité de la BHE aux molécules et aux cellules immunitaires 15,16,17. L’astrocyte, un type majeur de cellules gliales, est le dernier type de cellule composant la BHE. Les extrémités des astrocytes s’enroulent autour des tubes vasculaires EC-PC tandis que les corps cellulaires s’étendent dans le parenchyme cérébral, formant une connexion entre les neurones et le système vasculaire1. Des transporteurs distincts de solutés et de substrats sont localisés sur les extrémités des astrocytes (p. ex., l’aquaporine 4 [AQP-4]) qui jouent un rôle essentiel dans la fonction de la BHE 18,19,20,21.

La BHE est essentielle au maintien d’une bonne santé cérébrale, et un dysfonctionnement de la BHE a été signalé dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer (MA)22,23,24,25, la sclérose en plaques 7,26,27,28, l’épilepsie 29,30 et les accidents vasculaires cérébraux31,32. Il est de plus en plus reconnu que les anomalies cérébrovasculaires jouent un rôle central dans la neurodégénérescence, contribuant à une susceptibilité accrue aux événements ischémiques et hémorragiques. Par exemple, plus de 90 % des patients atteints de la maladie d’Alzheimer souffrent d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une affection caractérisée par le dépôt de β amyloïde (Aβ) le long du système vasculaire cérébral. L’ACA augmente la perméabilité à la BHE et diminue la fonction de la BHE, ce qui rend le SNC vulnérable à l’ischémie, aux événements hémorragiques et au déclin cognitif accéléré33.

Nous avons récemment développé un modèle in vitro de la BHE humaine, dérivé de cellules souches pluripotentes induites par le patient, qui intègre des CE, des PC et des astrocytes encapsulés dans une matrice 3D (Figure 1A). L’iBBB récapitule les interactions physiologiquement pertinentes, y compris la formation du tube vasculaire et la localisation des extrémités des astrocytes avec le système vasculaire24. Nous avons appliqué l’iBBB pour modéliser la susceptibilité à l’ACA médiée par l’APOE4 (Figure 1B). Cela nous a permis d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires causaux par lesquels l’APOE4 favorise l’AAC, et de tirer parti de ces connaissances pour développer des stratégies thérapeutiques qui réduisent la pathologie de l’AAC et améliorent l’apprentissage et la mémoire in vivo chez les souris APOE424. Ici, nous fournissons un protocole détaillé et un tutoriel vidéo pour reconstruire la BHE à partir de cellules iPS humaines et modéliser l’ACA in vitro.

Protocol

1. Différenciation des cellules iPS en cellules iBBB NOTE : Ces protocoles de différenciation ont déjà été décrits dans Mesentier-Louro et al.34. Enrobage de plaques de culture cellulaireDécongeler la matrice membranaire à facteur de croissance réduit (GF) pendant la nuit à 4 °C. Diluer 500 μL de matrice membranaire basale dans 49,5 mL de DMEM. Conservez cette solution au froid pour éviter une polymérisation prématuré…

Representative Results

Une iBBB correctement formée se solidifie en un seul disque translucide (Figure 3A). Il est normal que l’iBBB se détache de la surface sur laquelle il a été pipeté pour la première fois après quelques jours. Cela ne peut être évité, mais n’est pas une préoccupation majeure pour la bonne formation de l’iBBB si l’on prend soin de ne pas aspirer accidentellement l’iBBB lors du changement de support. Au bout de 24 h, des cellules individuelles uniformément réparties peuven…

Discussion

Le dysfonctionnement de la BHE est une comorbidité et, potentiellement, une cause ou un facteur aggravant dans de nombreuses maladies neurologiques 7,40,41. Cependant, il est presque impossible d’étudier la biologie moléculaire et cellulaire sous-jacente au dysfonctionnement et à la dégradation de la BHE chez les humains atteints de maladies neurovasculaires. La BHE inductible (iBBB) présentée dans ce protocole fournit …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par le NIH 3-UG3-NS115064-01, le R01NS14239, le Cure Alzheimer’s Fund, le NASA 80ARCO22CA004, l’Initiative Chan-Zuckerberg, la Fondation MJFF/ASAP et la Brain Injury Association of America. C.G. est soutenu par le NIH F31NS130909. La figure 1A a été créée avec BioRender.com.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Tags

Keywords: Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy
check_url/65921?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image