मॉडल और चिकित्सीय रूप से न्यूरोलॉजिकल रोग को लक्षित करने के लिए इन विट्रो में रक्त-मस्तिष्क बाधा का पुनर्निर्माण
Summary
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की एक स्थिर और स्वस्थ मस्तिष्क वातावरण को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका है। बीबीबी डिसफंक्शन कई न्यूरोलॉजिकल बीमारियों से जुड़ा हुआ है। हमने सेरेब्रोवास्कुलर पैथोलॉजी, बीबीबी अखंडता की जांच करने के लिए बीबीबी का एक 3 डी, स्टेम-सेल-व्युत्पन्न मॉडल विकसित किया है, और बीबीबी को आनुवंशिकी और बीमारी से कैसे बदल दिया जाता है।
Abstract
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक प्रमुख शारीरिक घटक है, पोषक तत्वों को बनाए रखता है, अपशिष्ट को साफ करता है, और मस्तिष्क को रोगजनकों से बचाता है। बीबीबी के अंतर्निहित बाधा गुण न्यूरोलॉजिकल रोगों के इलाज के लिए सीएनएस में चिकित्सीय दवा वितरण के लिए एक चुनौती पैदा करते हैं। बिगड़ा हुआ बीबीबी फ़ंक्शन न्यूरोलॉजिकल बीमारी से संबंधित है। सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए), सेरेब्रल वास्कुलचर में अमाइलॉइड का जमाव एक समझौता बीबीबी की ओर जाता है, अल्जाइमर रोग (एडी) के अधिकांश मामलों में एक सह-रुग्णता है, यह सुझाव देता है कि बीबीबी की शिथिलता या टूटना न्यूरोडीजेनेरेशन में शामिल हो सकता है। मानव बीबीबी ऊतक तक सीमित पहुंच के कारण, उचित बीबीबी फ़ंक्शन और बीबीबी अध: पतन में योगदान देने वाले तंत्र अज्ञात रहते हैं। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने 3 डी मैट्रिक्स में एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को शामिल करके एक मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीबीबी (आईबीबीबी) विकसित किया है। आईबीबीबीबी बीबीबी में मौजूद शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर इंटरैक्शन को पुन: व्यवस्थित करने के लिए स्वयं को इकट्ठा करता है। अमाइलॉइड के साथ iBBBs सीडिंग CAA के प्रमुख पहलुओं को पकड़ती है। इसके अतिरिक्त, iBBB सेरेब्रोवास्कुलर रोग और न्यूरोडीजेनेरेशन में फंसे आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों को संशोधित करने के लिए एक लचीला मंच प्रदान करता है, यह जांचने के लिए कि आनुवंशिकी और जीवन शैली रोग जोखिम को कैसे प्रभावित करती है। अंत में, iBBB दवा स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सीएनएस के लिए चिकित्सीय वितरण का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली तीन प्रकार की कोशिकाओं (एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स) के भेदभाव का वर्णन करते हैं, आईबीबीबीबी में विभेदित कोशिकाओं को कैसे इकट्ठा किया जाए, और बहिर्जात एमिलॉयड का उपयोग करके इन विट्रो में सीएए को कैसे मॉडल किया जाए। यह मॉडल एक ऐसी प्रणाली के साथ जीवित मानव मस्तिष्क के ऊतकों का अध्ययन करने की चुनौती पर काबू पाता है जिसमें जैविक निष्ठा और प्रयोगात्मक लचीलापन दोनों होते हैं, और मानव बीबीबी की पूछताछ और न्यूरोडीजेनेरेशन में इसकी भूमिका को सक्षम बनाता है।
Introduction
रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक प्रमुख माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क है जो उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए एक आदर्श वातावरण बनाए रखने के लिए परिधि से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को अलग करता है। चयापचय होमियोस्टेसिस 1,2,3,4 को बनाए रखने, अपशिष्ट 4,5,6 को साफ करने और रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों 7,8 से मस्तिष्क की रक्षा करके सीएनएस में पदार्थों की आमद और प्रवाह को विनियमित करने में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका है।
बीबीबी का प्राथमिक सेल प्रकार एंडोथेलियल सेल (ईसी) है। एंडोथेलियल कोशिकाएं, मेसोडर्म वंश से व्युत्पन्न, वास्कुलचर 1,9 की दीवारों का निर्माण करती हैं। माइक्रोवैस्कुलर ईसी एक दूसरे के साथ तंग जंक्शन बनाते हैं ताकि उनकी झिल्ली 10,11,12,13,14 की पारगम्यता को कम किया जा सके, जबकि ट्रांसपोर्टरों को सीएनएस 1,4,12,14 में पोषक तत्वों की आवाजाही को सुविधाजनक बनाने के लिए व्यक्त किया जा सके . माइक्रोवैस्कुलर ईसी पेरिसाइट्स (पीसी) -भित्ति कोशिकाओं से घिरे होते हैं जो माइक्रोवैस्कुलर फ़ंक्शन और होमियोस्टेसिस को विनियमित करते हैं और अणुओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं 15,16,17के लिए बीबीबी की पारगम्यता को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एस्ट्रोसाइट, एक प्रमुख ग्लियल सेल प्रकार, बीबीबी में शामिल अंतिम सेल प्रकार है। एस्ट्रोसाइट अंत-पैर ईसी-पीसी संवहनी ट्यूबों के चारों ओर लपेटते हैं जबकि कोशिका शरीर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में विस्तारित होते हैं, जिससे न्यूरॉन्स और वास्कुलचर1 के बीच संबंध बनता है। विशिष्ट विलेय और सब्सट्रेट ट्रांसपोर्टर एस्ट्रोसाइट एंड-फीट (जैसे, एक्वापोरिन 4 [एक्यूपी -4]) पर स्थानीयकृत होते हैं जिनकी बीबीबी फ़ंक्शन 18,19,20,21में महत्वपूर्ण भूमिका होती है।
बीबीबी उचित मस्तिष्क स्वास्थ्य समारोह को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है, और बीबीबी की शिथिलता अल्जाइमर रोग (एडी) 22,23,24,25, मल्टीपल स्केलेरोसिस 7,26,27,28, मिर्गी 29,30 और स्ट्रोक31,32 सहित कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में बताई गई है. यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि सेरेब्रोवास्कुलर असामान्यताएं न्यूरोडीजेनेरेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं, इस्केमिक और रक्तस्रावी घटनाओं के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि में योगदान करती हैं। उदाहरण के लिए, 90% से अधिक एडी रोगियों में सेरेब्रल एमिलॉइड एंजियोपैथी (सीएए) होती है, जो मस्तिष्क वाहिका के साथ अमाइलॉइड β (एβ) के जमाव की विशेषता वाली स्थिति है। सीएए बीबीबी पारगम्यता बढ़ जाती है और बीबीबी समारोह कम हो जाती है, सीएनएस इस्किमिया, रक्तस्रावी घटनाओं के लिए कमजोर छोड़ने, और त्वरित संज्ञानात्मक गिरावट33.
हमने हाल ही में मानव बीबीबी के इन विट्रो मॉडल में विकसित किया है, जो रोगी-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होता है, जिसमें ईसी, पीसी, और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं जो 3 डी मैट्रिक्स(चित्रा 1ए)में समाहित हैं। आईबीबीबीबी शारीरिक रूप से प्रासंगिक इंटरैक्शन को पुन: प्रस्तुत करता है, जिसमें संवहनी ट्यूब गठन और वास्कुलचर24 के साथ एस्ट्रोसाइट एंड-फीट का स्थानीयकरण शामिल है। हमने एपीओई 4 (चित्रा 1 बी) द्वारा मध्यस्थता सीएए की संवेदनशीलता को मॉडल करने के लिए आईबीबीबीबी लागू किया। इसने हमें कारण सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने में सक्षम बनाया जिसके द्वारा APOE4 CAA को बढ़ावा देता है, और चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए इन अंतर्दृष्टि का लाभ उठाता है जो CAA पैथोलॉजी को कम करता है और APOE4 चूहों24 में विवो में सीखने और स्मृति में सुधार करता है। यहां, हम मानव आईपीएससी से बीबीबी के पुनर्निर्माण और इन विट्रो में सीएए मॉडलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और वीडियो ट्यूटोरियल प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीबीबी डिसफंक्शन एक सह-रुग्णता है, और संभावित रूप से, कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में एक कारण या उत्तेजक कारक 7,40,41. हालांकि, न्यूरोवास्कुलर रोग वाले मनुष्यों में बीबीबी की श…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच 3-यूजी 3-NS115064-01, R01NS14239, क्योर अल्जाइमर फंड, नासा 80ARCO22CA004, चान-जुकरबर्ग इनिशिएटिव, एमजेएफएफ / एएसएपी फाउंडेशन और ब्रेन इंजरी एसोसिएशन ऑफ अमेरिका द्वारा समर्थित है। सीजी एनआईएच F31NS130909 द्वारा समर्थित है। चित्रा 1 ए BioRender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| 6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Activin A | Peprotech | 20-14E | |
| Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
| Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
| Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
| Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
| Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
| B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
| BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
| CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
| Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
| Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
| GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
| Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
| LDN193189 | Tocris | 6053 | |
| Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
| Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
| PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
| Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
| S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
| SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
| Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
| VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
| ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
References
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
- Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
- Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
- Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
- Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
- Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
- Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
- Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
- Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
- Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
- Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
- Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
- Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
- Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
- Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
- Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
- Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
- Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
- Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
- Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
- Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
- Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
- Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
- Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
- Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
- Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
- Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).
