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Neuroscience

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

Summary

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l’integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Abstract

La barriera emato-encefalica (BBB) è una componente fisiologica chiave del sistema nervoso centrale (SNC), che mantiene i nutrienti, elimina i rifiuti e protegge il cervello dagli agenti patogeni. Le proprietà di barriera intrinseche della BBB rappresentano una sfida per la somministrazione di farmaci terapeutici nel sistema nervoso centrale per il trattamento di malattie neurologiche. La compromissione della funzione della BBB è stata correlata a malattie neurologiche. L’angiopatia amiloide cerebrale (CAA), la deposizione di amiloide nella vascolarizzazione cerebrale che porta a una BBB compromessa, è una comorbilità nella maggior parte dei casi di malattia di Alzheimer (AD), suggerendo che la disfunzione o la rottura della BBB può essere coinvolta nella neurodegenerazione. A causa dell’accesso limitato al tessuto BBB umano, i meccanismi che contribuiscono alla corretta funzione e alla degenerazione della BBB rimangono sconosciuti. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una BBB derivata da cellule staminali pluripotenti umane (iBBB) incorporando cellule endoteliali, periciti e astrociti in una matrice 3D. L’iBBB si auto-assembla per ricapitolare l’anatomia e le interazioni cellulari presenti nella BBB. La semina di iBBB con amiloide cattura gli aspetti chiave della CAA. Inoltre, l’iBBB offre una piattaforma flessibile per modulare i fattori genetici e ambientali implicati nelle malattie cerebrovascolari e nella neurodegenerazione, per studiare come la genetica e lo stile di vita influenzano il rischio di malattia. Infine, l’iBBB può essere utilizzato per lo screening dei farmaci e gli studi di chimica farmaceutica per ottimizzare la somministrazione terapeutica al SNC. In questo protocollo, descriviamo la differenziazione dei tre tipi di cellule (cellule endoteliali, periciti e astrociti) derivanti da cellule staminali pluripotenti umane, come assemblare le cellule differenziate nell’iBBB e come modellare CAA in vitro utilizzando amiloide esogena. Questo modello supera la sfida di studiare il tessuto cerebrale umano vivo con un sistema che ha sia fedeltà biologica che flessibilità sperimentale, e consente di interrogare la BBB umana e il suo ruolo nella neurodegenerazione.

Introduction

La barriera emato-encefalica (BBB) è una rete microvascolare chiave che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dalla periferia per mantenere un ambiente ideale per una corretta funzione neuronale. Ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell’afflusso e dell’efflusso di sostanze nel sistema nervoso centrale mantenendo l’omeostasi metabolica 1,2,3,4, eliminando i rifiuti 4,5,6 e proteggendo il cervello da agenti patogeni e tossine 7,8.

Il tipo di cellula primaria della BBB è la cellula endoteliale (EC). Le cellule endoteliali, derivate dalla linea mesodermica, formano le pareti del sistema vascolare 1,9. Le EC microvascolari formano giunzioni strette tra loro per ridurre notevolmente la permeabilità della loro membrana 10,11,12,13,14 mentre esprimono trasportatori per facilitare il movimento dei nutrienti dentro e fuori il SNC 1,4,12,14. Le EC microvascolari sono circondate da periciti (PC) – cellule murali che regolano la funzione microvascolare e l’omeostasi e sono fondamentali per regolare la permeabilità della BBB alle molecole e alle cellule immunitarie 15,16,17. L’astrocita, un importante tipo di cellula gliale, è l’ultimo tipo di cellula che comprende la BBB. Le estremità degli astrociti si avvolgono attorno ai tubi vascolari EC-PC mentre i corpi cellulari si estendono nel parenchima cerebrale, formando una connessione tra neuroni e vascolarizzazione1. Trasportatori distinti di soluti e substrati sono localizzati sulle estremità degli astrociti (ad esempio, l’acquaporina 4 [AQP-4]) che hanno un ruolo critico nella funzioneBBB 18,19,20,21.

La BBB è fondamentale per mantenere la corretta funzione della salute del cervello e la disfunzione della BBB è stata segnalata in molte malattie neurologiche, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) 22,23,24,25, la sclerosi multipla 7,26,27,28, l’epilessia 29,30 e l’ictus31,32. È sempre più riconosciuto che le anomalie cerebrovascolari svolgono un ruolo centrale nella neurodegenerazione, contribuendo ad aumentare la suscettibilità agli eventi ischemici ed emorragici. Ad esempio, oltre il 90% dei pazienti con AD ha angiopatia amiloide cerebrale (CAA), una condizione caratterizzata dalla deposizione di β amiloide (Aβ) lungo la vascolarizzazione cerebrale. La CAA aumenta la permeabilità della BBB e diminuisce la funzione della BBB, lasciando il SNC vulnerabile all’ischemia, agli eventi emorragici e al declino cognitivo accelerato33.

Recentemente abbiamo sviluppato un modello in vitro della BBB umana, derivato da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente, che incorpora EC, PC e astrociti incapsulati in una matrice 3D (Figura 1A). L’iBBB ricapitola le interazioni fisiologicamente rilevanti, tra cui la formazione del tubo vascolare e la localizzazione delle estremità degli astrociti con la vascolarizzazione24. Abbiamo applicato l’iBBB per modellare la suscettibilità alla CAA mediata da APOE4 (Figura 1B). Questo ci ha permesso di identificare i meccanismi cellulari e molecolari causali attraverso i quali APOE4 promuove la CAA e di sfruttare queste intuizioni per sviluppare strategie terapeutiche che riducano la patologia CAA e migliorino l’apprendimento e la memoria in vivo nei topi APOE424. Qui, forniamo un protocollo dettagliato e un video tutorial per ricostruire la BBB da iPSC umane e modellare CAA in vitro.

Protocol

1. Differenziare le iPSC in cellule iBBB NOTA: Questi protocolli di differenziazione sono stati precedentemente descritti in Mesentier-Louro et al.34. Piastre per colture cellulari di rivestimentoScongelare la matrice di membrana con fattore di crescita ridotto (GF) durante la notte a 4 °C. Diluire 500 μL di matrice di membrana basale in 49,5 mL di DMEM. Mantenere questa soluzione fredda per evitare la polimerizzazione prematura del…

Representative Results

Un iBBB correttamente formato si solidifica in un singolo disco traslucido (Figura 3A). È normale che l’iBBB si stacchi dalla superficie su cui è stato pipettato per la prima volta dopo alcuni giorni. Questo non può essere evitato, ma non è una grande preoccupazione per la corretta formazione dell’iBBB se si presta attenzione quando si cambia il supporto per non aspirare accidentalmente l’iBBB. Dopo 24 ore, le singole cellule uniformemente distribuite possono essere identificate al micro…

Discussion

La disfunzione della BBB è una comorbilità e, potenzialmente, una causa o un fattore esacerbante in numerose malattie neurologiche 7,40,41. Tuttavia, è quasi impossibile studiare la biologia molecolare e cellulare alla base della disfunzione e della degradazione della BBB negli esseri umani con malattie neurovascolari. La BBB inducibile (iBBB) presentata in questo protocollo fornisce un sistema in vitro che ricapitol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation e Brain Injury Association of America. C.G. è supportato da NIH F31NS130909. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
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References

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Keywords: Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy
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Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
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