Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica
Summary
La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.
Abstract
La barrera hematoencefálica (BHE) es un componente fisiológico clave del sistema nervioso central (SNC), que mantiene los nutrientes, elimina los desechos y protege el cerebro de los patógenos. Las propiedades de barrera inherentes de la barrera hematoencefálica plantean un desafío para la administración de fármacos terapéuticos en el SNC para tratar enfermedades neurológicas. El deterioro de la función de la BHE se ha relacionado con enfermedades neurológicas. La angiopatía amiloide cerebral (AAC), el depósito de amiloide en la vasculatura cerebral que conduce a una BHE comprometida, es una comorbilidad en la mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer (EA), lo que sugiere que la disfunción o descomposición de la BHE puede estar involucrada en la neurodegeneración. Debido al acceso limitado al tejido humano de la BHE, los mecanismos que contribuyen a la función adecuada de la BHE y a la degeneración de la BHE siguen siendo desconocidos. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado una BHE derivada de células madre pluripotentes humanas (iBBB) mediante la incorporación de células endoteliales, pericitos y astrocitos en una matriz 3D. El iBBB se autoensambla para recapitular la anatomía y las interacciones celulares presentes en el BBB. La siembra de iBBB con amiloide captura aspectos clave de la AAC. Además, el iBBB ofrece una plataforma flexible para modular los factores genéticos y ambientales implicados en las enfermedades cerebrovasculares y la neurodegeneración, para investigar cómo la genética y el estilo de vida afectan el riesgo de enfermedad. Por último, el iBBB se puede utilizar para el cribado de fármacos y estudios de química médica para optimizar la administración terapéutica al SNC. En este protocolo, describimos la diferenciación de los tres tipos de células (células endoteliales, pericitos y astrocitos) que surgen de células madre pluripotentes humanas, cómo ensamblar las células diferenciadas en el iBBB y cómo modelar CAA in vitro utilizando amiloide exógeno. Este modelo supera el reto de estudiar tejido cerebral humano vivo con un sistema que tiene tanto fidelidad biológica como flexibilidad experimental, y permite interrogar la BHE humana y su papel en la neurodegeneración.
Introduction
La barrera hematoencefálica (BHE) es una red microvascular clave que separa el sistema nervioso central (SNC) de la periferia para mantener un entorno ideal para una función neuronal adecuada. Tiene un papel fundamental en la regulación de la entrada y salida de sustancias en el SNC mediante el mantenimiento de la homeostasis metabólica 1,2,3,4, la eliminación de desechos 4,5,6 y la protección del cerebro de patógenos y toxinas 7,8.
El tipo de célula primaria de la BHE es la célula endotelial (CE). Las células endoteliales, derivadas del linaje del mesodermo, forman las paredes de la vasculatura 1,9. Las CE microvasculares forman uniones estrechas entre sí para disminuir en gran medida la permeabilidad de su membrana 10,11,12,13,14 mientras expresan transportadores para facilitar el movimiento de nutrientes dentro y fuera del SNC 1,4,12,14 . Las CE microvasculares están rodeadas por células murales de pericitos (PC) que regulan la función microvascular y la homeostasis y son fundamentales para regular la permeabilidad de la BHE a las moléculas y células inmunitarias 15,16,17. El astrocito, un tipo de célula glial importante, es el último tipo de célula que comprende la BHE. Los pies terminales de los astrocitos se envuelven alrededor de los tubos vasculares EC-PC, mientras que los cuerpos celulares se extienden hacia el parénquima cerebral, formando una conexión entre las neuronas y lavasculatura. En los extremos de los astrocitos (p. ej., acuaporina 4 [AQP-4]) se localizan distintos transportadores de solutos y sustratos que tienen un papel crítico en la función de la BHE 18,19,20,21.
La BHE es fundamental para mantener la función adecuada de la salud cerebral, y se ha descrito una disfunción de la BHE en muchas enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer (EA)22,23,24,25, la esclerosis múltiple 7,26,27,28, la epilepsia 29,30 y el accidente cerebrovascular31,32. Cada vez se reconoce más que las anomalías cerebrovasculares desempeñan un papel central en la neurodegeneración, contribuyendo a una mayor susceptibilidad a los eventos isquémicos y hemorrágicos. Por ejemplo, más del 90% de los pacientes con EA tienen angiopatía amiloide cerebral (AAC), una afección caracterizada por el depósito de β amiloide (Aβ) a lo largo de la vasculatura cerebral. La AAC aumenta la permeabilidad a la BHE y disminuye la función de la BHE, dejando al SNC vulnerable a la isquemia, los eventos hemorrágicos y el deterioro cognitivo acelerado33.
Recientemente hemos desarrollado un modelo in vitro de la BHE humana, derivado de células madre pluripotentes inducidas por el paciente, que incorpora CEs, PCs y astrocitos encapsulados en una matriz 3D (Figura 1A). El iBBB recapitula las interacciones fisiológicamente relevantes, incluyendo la formación del tubo vascular y la localización de los extremos de los astrocitos con la vasculatura24. Se aplicó el iBBB para modelar la susceptibilidad de la AAC mediada por APOE4 (Figura 1B). Esto nos permitió identificar los mecanismos celulares y moleculares causales por los cuales APOE4 promueve la AAC, y aprovechar estos conocimientos para desarrollar estrategias terapéuticas que reduzcan la patología de la AAC y mejoren el aprendizaje y la memoria in vivo en ratones APOE424. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado y un video tutorial para reconstruir la BHE a partir de iPSC humanas y modelar CAA in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La disfunción de la BHE es una comorbilidad y, potencialmente, una causa o factor exacerbante en numerosas enfermedades neurológicas 7,40,41. Sin embargo, es casi imposible estudiar la biología molecular y celular que subyace a la disfunción y la degradación de la BHE en humanos con enfermedad neurovascular. La BHE inducible (iBBB) presentada en este protocolo proporciona un sistema in vitro que recapitula importan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation y Brain Injury Association of America. C.G. cuenta con el apoyo de NIH F31NS130909. La Figura 1A se creó con BioRender.com.
Materials
| 6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Activin A | Peprotech | 20-14E | |
| Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
| Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
| Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
| Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
| Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
| B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
| BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
| CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
| Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
| Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
| GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
| Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
| LDN193189 | Tocris | 6053 | |
| Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
| Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
| PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
| Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
| S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
| SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
| Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
| VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
| ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
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