הערכה של אצה אדומה Gracilaria gracilis באמצעות גישה של זיקוק ביולוגי
Summary
במאמר זה אנו מתארים מספר פרוטוקולים המכוונים להערכה משולבת של Gracilaria gracilis: קציר מיני בר, גידול פנימי ומיצוי של מרכיבים ביו-אקטיביים. ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי-מיקרוביאליות והציטוטוקסיות של התמציות נבדקות, יחד עם הערכה תזונתית ויציבותית של מזון מועשר בביומסה ופיגמנטים של אצות שלמות.
Abstract
העניין באצות ים כחומר גלם שופע להשגת מרכיבים ביו-אקטיביים יקרי ערך ורב-תכליתיים גדל ללא הרף. בעבודה זו, אנו חוקרים את הפוטנציאל של Gracilaria gracilis, אצה אדומה אכילה, המעובדת ברחבי העולם בשל העניין המסחרי שלה כמקור לאגר ומרכיבים אחרים ליישומים קוסמטיים, פרמקולוגיים, מזון והזנה.
תנאי הגידול של G. gracilis עברו אופטימיזציה באמצעות ריבוי וגטטיבי ונבגים תוך מניפולציה של התנאים הפיזיקוכימיים כדי להשיג מלאי ביומסה גדול. מתודולוגיות מיצוי ירוקות עם אתנול ומים בוצעו על גבי ביומסה של אצות. הפוטנציאל הביו-אקטיבי של תמציות הוערך באמצעות סדרה של בדיקות במבחנה בנוגע לציטוטוקסיות, נוגדות חמצון ותכונות אנטי-בקטריאליות שלהן. נוסף על כך, ביומסה של אצות מיובשות שולבה בפורמולות פסטה כדי להעלות את הערך התזונתי של המזון. פיגמנטים שהופקו מ- G. gracilis שולבו גם ביוגורט כצבע טבעי, ויציבותם הוערכה. שני המוצרים הוגשו להערכה של פאנל חושי מאומן למחצה שמטרתו להשיג את הנוסחה הסופית הטובה ביותר לפני ההגעה לשוק.
התוצאות תומכות ברבגוניות של G. gracilis בין אם הוא מיושם כביומסה שלמה, תמציות ו / או פיגמנטים. באמצעות יישום מספר פרוטוקולים מותאמים, עבודה זו מאפשרת פיתוח מוצרים בעלי פוטנציאל להרוויח בשוקי המזון, הקוסמטיקה והחקלאות הימית, קידום קיימות סביבתית וכלכלה מעגלית כחולה.
יתר על כן, ובהתאם לגישת הזיקוק הביולוגי, הביומסה השיורית של האצות תשמש כביוסטימולנט לגידול צמחים או תומר לחומרי פחמן שישמשו לטיהור מים של מערכות החקלאות הימית של MARE-Polytechnic מלייריה, פורטוגל.
Introduction
אצות ים יכולות להיחשב כחומר גלם טבעי מעניין שיש להרוויח ממנו על ידי מגזרי התרופות, המזון, המזון ואיכות הסביבה. הם מסנתזים ביולוגית מגוון של מולקולות, רבות מהן אינן נמצאות באורגניזמים יבשתיים, עם תכונות ביולוגיות רלוונטיות 1,2. עם זאת, פרוטוקולי גידול אופטימליים לאצות ים צריכים להיות מיושמים כדי להבטיח מלאי ביומסה גדול.
שיטות גידול חייבות תמיד לקחת בחשבון את אופי התאלי האצות ואת המורפולוגיה הכוללת. Gracilaria gracilis הוא טקסון משובט, כלומר איבר ההתקשרות מייצר מספר צירים צמחיים. כך מושגת התפשטות על ידי פיצול (רבייה וגטטיבית), שכן כל אחד מהצירים הללו מסוגל לאמץ חיים עצמאיים מהתאלוס הראשי3. טקסה קלונלית יכולה להשתלב בהצלחה עם מתודולוגיות גידול פשוטות ומהירות בצעד אחד, שכן כמויות גדולות של ביומסה מתקבלות על ידי פיצול התאלוס למקטעים קטנים המתחדשים במהירות וגדלים לפרטים חדשים זהים גנטית. ניתן להשתמש הן בתאלי הפלונטי והן בתאלי הדיפלונטי בתהליך זה. אף על פי שהסוג מציג מחזור חיים משולש איזומורפי הפלו-דיפלונטי מורכב, רק לעתים רחוקות יש צורך בנבגים, למעט כאשר נדרשת התחדשות גנטית של המלאי כדי להשיג יבולים משופרים. במקרה זה, הן tetraspores (נבגים haplontic שנוצרו על ידי meiosis) ו carpospores (נבגים דיפלונטיים שנוצרו על ידי מיטוזה) ליצור thalli macroscopic כי אז ניתן לגדל ולהפיץ על ידי רבייה צמחית4. מחזורי הצמיחה מוכתבים על ידי התנאים הסביבתיים והמצב הפיזיולוגי של הפרטים, בין גורמים ביולוגיים אחרים כגון הופעתם של אפיפיטים והיצמדות של אורגניזמים אחרים. לכן, אופטימיזציה של תנאי הגידול חיונית כדי להבטיח פרודוקטיביות גבוהה ולייצר ביומסה באיכות טובה5.
מיצוי של תרכובות ביו-אקטיביות מאצות, כולל G. gracilis, יכול להיות מושג בשיטות שונות 6,7. בחירת שיטת המיצוי תלויה בתרכובות העניין הספציפיות, ביישום היעד ובמאפייני האצות. במחקר זה התמקדנו במיצוי ממסים, הכולל שימוש בממסים ירוקים, כגון מים או אתנול, כדי להמיס ולמצות תרכובות ביו-אקטיביות מהביומסה של האצות. המיצוי יכול להתבצע באמצעות maceration בצורה תכליתית ויעילה והוא יכול לשמש למגוון רחב של תרכובות. זוהי שיטה פשוטה ונפוצה הכוללת השריית ביומסה בממס לתקופה ממושכת, בדרך כלל בטמפרטורות החדר או מעט גבוהות. את הממס מערבבים כדי לשפר את תהליך המיצוי. לאחר זמן המיצוי הרצוי, הממס מופרד מהחומר המוצק על ידי סינון או צנטריפוגה.
מים הם ממס נפוץ ביישומי מזון בשל בטיחותם, זמינותם והתאמתם למגוון רחב של מוצרי מזון. מיצוי מים מתאים לתרכובות קוטביות כגון רב-סוכרים, פפטידים ופנולים מסוימים. עם זאת, ייתכן שהוא לא יחלץ ביעילות תרכובות שאינן קוטביות. אתנול הוא גם ממס בשימוש נרחב ביישומי מזון והוא יכול להיות יעיל למיצוי מגוון מולקולות ביו-אקטיביות, כולל תרכובות פנוליות, פלבנואידים ופיגמנטים מסוימים. אתנול מוכר בדרך כלל כבטוח לשימוש במזון וניתן להתאדות בקלות, תוך השארת התרכובות המחולצות מאחור. ראוי לציין כי הבחירה של שיטת מיצוי צריך לשקול גורמים כגון יעילות, סלקטיביות, עלות-תועלת, והשפעה על הסביבה. אופטימיזציה של פרמטרים של מיצוי, כגון ריכוז הממס, זמן המיצוי, הטמפרטורה והלחץ, חיונית להשגת יבולים אופטימליים של תרכובות ביו-אקטיביות מ- G. gracilis או מאצות אחרות.
נמצא כי אצות ים מפגינות פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, כולל חיידקים, פטריות ונגיפים8. פעילות זו מיוחסת לרכיבים ביו-אקטיביים, כולל פנולים, רב-סוכרים, פפטידים וחומצות שומן. מספר מחקרים הוכיחו את יעילותם נגד פתוגנים כגון Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ו – Pseudomonas aeruginosa, בין היתר9. הפעילות האנטי-בקטריאלית של אצות מיוחסת לנוכחות של תרכובות ביו-אקטיביות שיכולות להפריע לדפנות התאים המיקרוביאליים, לממברנות, לאנזימים ולמסלולי איתות10. תרכובות אלה עלולות לשבש את גדילת החיידקים, לעכב היווצרות ביופילם ולווסת תגובות חיסוניות.
אצות אדומות, הידועות גם בשם רודופיטים, הן קבוצה של אצות שיכולות להפגין פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון מיקרואורגניזמים. בתוך קבוצה זו, G. gracilis מכיל תרכובות ביו-אקטיביות שונות שעשויות לתרום לפעילות האנטי-מיקרוביאלית המדווחת שלו. בעוד שהמולקולות הספציפיות יכולות להשתנות, הסוגים הנפוצים שדווחו ב- G. gracilis ועשויים להיות בעלי תכונות מיקרוביאליות הם רב-סוכרים, פנולים, טרפנואידים ופיגמנטים11. עם זאת, חשוב לציין כי נוכחותם וכמותם של רכיבים אלה יכולה להשתנות בהתאם לגורמים כגון מיקום איסוף האצות, עונתיות, מצב פיזיולוגי של התאלי ותנאי הסביבה. לכן, הסוג והריכוז הספציפיים של תרכובות מיקרוביאליות ב- G. gracilis עשויים להשתנות בהתאם.
G. gracilis נמצא גם כבעל תכונות נוגדות חמצון, המכילות תרכובות פנוליות שונות, אשר הוכחו כמסלקות רדיקלים חופשיים ומפחיתות עקה חמצונית12.נוגדי חמצון עוזרים להגן על התאים מפני נזקים שנגרמים על-ידי מיני חמצן תגובתיים, ויש להם יתרונות בריאותיים פוטנציאליים. ניתן להעריך את יכולת נוגדי החמצון ישירות באמצעות שיטות שונות, כולל פעילות ניקוי רדיקלים חופשיים 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ובעקיפין, באמצעות כימות התוכן הפוליפנולי הכולל (TPC)13.
למרות שמדווח שלמרכיב יש פעילות ביולוגית בולטת, הערכת ציטוטוקסיות שלו היא הכרחית בהערכת חומרים טבעיים וסינתטיים שישמשו במגע עם תאים או רקמות חיים. ישנן מספר שיטות למדידת ציטוטוקסיות, כל אחת עם יתרונות ומגבלות. בסך הכל, הם מציעים מגוון אפשרויות להעריך את ההשפעות המזיקות של חומרים רבים על תאים, ובו בזמן, לחקור את המנגנונים של נזק לתאים ומוות14.
בעבודה זו, אנו משתמשים 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, שיטה קולורימטרית שהוצגה על ידי Mosmann (1983)15. שיטה זו מודדת את הפחתת מלחי הטטרזוליום לתוצר פורמזן סגול על ידי תאים פעילים מטבולית. ככל שכמות גבישי הפורמזן גבוהה יותר, כך גדל מספר התאים בני הקיימא, ובכך ניתן מדד עקיף לציטוטוקסיות14. מכיוון שבעבודה זו, תמציות מים ואתנול של G. gracilis מיועדות להשתלב בפורמולציות דרמו-קוסמטיות, הערכת ציטוטוקסיות במבחנה מבוצעת בקו תאי קרטינוציטים (HaCaT).
לגבי יישום המזון, אצות ים בדרך כלל דלות קלוריות ועשירות מבחינה תזונתית בסיבים תזונתיים, יסודות חיוניים וחומצות אמינו, פוליסכרידים, חומצות שומן רב בלתי רוויות, פוליפנולים וויטמינים 2,16. G. gracilis אינו יוצא מן הכלל, בעל ערך תזונתי מעניין. Freitas et al. (2021)4 מצאו כי G. gracilis מתורבת היה בעל רמות גבוהות יותר של חלבון וויטמין C ושמר על רמת השומנים הכוללת בהשוואה לאצות בר. הדבר עשוי להוות יתרון כלכלי וסביבתי, שכן מבחינה תזונתית הייצור עדיף על ניצול משאבי הבר. בנוסף, הצרכנים מודאגים יותר ויותר מסוג המזון שהם אוכלים, ולכן חשוב להכניס מרכיבים חדשים להעשרת המזון ולהשתמש במשאבים חדשים כדי להשיג תמציות שיכולות להוסיף ערך למוצר ולטעון ל”תווית נקייה”. חוץ מזה, השוק הנוכחי הוא תחרותי מאוד, הדורש פיתוח של מוצרים חדשים ואסטרטגיות חדשניות כדי להבדיל יצרנים מן המתחרים שלהם17.
העשרת מוצרים בעלי ערך תזונתי ירוד, כגון פסטה, במשאבים ימיים, כולל אצות, היא אסטרטגיה להחדרת משאב זה כמזון חדש וכאסטרטגיית בידול שוק באמצעות מוצר בעל ערך תזונתי מובהק. מצד שני, G. gracilis הוא מקור של פיגמנטים אדומים טבעיים כגון phycobiliproteins18, בעל פוטנציאל גבוה ליישומים בתעשיית המזון. אצה זו הראתה עניין רב במספר תחומים, וניתן ליישם אותה באמצעות אצות שלמות, תמציות ו / או הביומסה שנותרה. בעבודה זו, אנו מדגימים כמה דוגמאות של יישומים כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקות הפעילות האנטי-מיקרוביאלית בתווך נוזלי משמשות להערכת יעילותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים כנגד מיקרואורגניזמים המרחפים בתווך נוזלי ומבוצעות בדרך כלל כדי לקבוע את יכולתו של חומר לעכב גדילה או להרוג מיקרואורגניזמים 35,36,37,38<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT) באמצעות פרויקטים אסטרטגיים שהוענקו למרכז MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 ו- UIDB/04292/2020), ולמעבדה עמיתה ARNET (LA/P/0069/2020). FCT גם מימנה את מענקי הדוקטורט האישיים שהוענקו למרתה ו. פרייטס (UI/BD/150957/2021) וטטיאנה פריירה (2021. 07791. ב”ד). עבודה זו נתמכה כספית גם על ידי פרויקט HP4A – פסטה בריאה לכולם (קידום משותף מס ‘039952), במימון משותף של ERDF – הקרן האירופית לפיתוח אזורי, במסגרת תוכנית פורטוגל 2020, באמצעות COMPETE 2020 – תחרותיות ובינאום תוכנית תפעולית.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
