Valorizzazione dell'alga rossa Gracilaria gracilis attraverso un approccio di bioraffineria
Summary
In questo articolo descriviamo diversi protocolli che mirano ad una valorizzazione integrata della Gracilaria gracilis: la raccolta di specie selvatiche, la crescita interna e l’estrazione di ingredienti bioattivi. Vengono valutati gli effetti antiossidanti, antimicrobici e citotossici degli estratti, insieme alla valutazione nutrizionale e della stabilità degli alimenti arricchiti con biomassa e pigmenti di alghe intere.
Abstract
L’interesse per le alghe marine come materia prima abbondante per ottenere ingredienti bioattivi preziosi e multitarget è in continua crescita. In questo lavoro, esploriamo il potenziale della Gracilaria gracilis, un’alga rossa commestibile coltivata in tutto il mondo per il suo interesse commerciale come fonte di agar e altri ingredienti per applicazioni cosmetiche, farmacologiche, alimentari e mangimistiche.
Le condizioni di crescita di G. gracilis sono state ottimizzate attraverso la propagazione vegetativa e la sporulazione, manipolando le condizioni fisico-chimiche per ottenere un ampio stock di biomassa. Le metodologie di estrazione verde con etanolo e acqua sono state eseguite sulla biomassa delle alghe. Il potenziale bioattivo degli estratti è stato valutato attraverso una serie di saggi in vitro riguardanti la loro citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche. Inoltre, la biomassa di alghe essiccate è stata incorporata nelle formulazioni della pasta per aumentare il valore nutrizionale degli alimenti. I pigmenti estratti da G. gracilis sono stati anche incorporati nello yogurt come colorante naturale ed è stata valutata la loro stabilità. Entrambi i prodotti sono stati sottoposti all’apprezzamento di un panel sensoriale semi-addestrato con l’obiettivo di ottenere la migliore formulazione finale prima di raggiungere il mercato.
I risultati confermano la versatilità di G. gracilis sia che venga applicato come biomassa intera, estratti e/o pigmenti. Attraverso l’implementazione di diversi protocolli ottimizzati, questo lavoro consente lo sviluppo di prodotti con il potenziale di profitto nei mercati alimentare, cosmetico e dell’acquacoltura, promuovendo la sostenibilità ambientale e un’economia circolare blu.
Inoltre, e in linea con un approccio di bioraffineria, la biomassa residua di alghe marine sarà utilizzata come biostimolante per la crescita delle piante o convertita in materiali di carbonio da utilizzare nella purificazione delle acque dei sistemi di acquacoltura interni del MARE-Politecnico di Leiria, in Portogallo.
Introduction
Le alghe possono essere considerate un’interessante materia prima naturale da trarre profitto dai settori farmaceutico, alimentare, dei mangimi e ambientale. Biosintetizzano una panoplia di molecole, molte delle quali non presenti negli organismi terrestri, con proprietà biologiche rilevanti 1,2. Tuttavia, è necessario implementare protocolli di coltivazione ottimizzati per le alghe marine per garantire un ampio stock di biomassa.
I metodi di coltivazione devono sempre tenere conto della natura dei talli delle alghe e della morfologia complessiva. Gracilaria gracilis è un taxon clonale, il che significa che l’organo di attacco produce più assi vegetativi. Si ottiene così la propagazione per frammentazione (riproduzione vegetativa), in quanto ciascuno di questi assi è pienamente in grado di adottare una vita indipendente dal tallo principale3. I taxa clonali possono essere integrati con successo con metodologie di coltivazione semplici e veloci in un solo passaggio, poiché grandi quantità di biomassa si ottengono dividendo il tallo in piccoli frammenti che si rigenerano rapidamente e crescono in nuovi individui geneticamente identici. In questo processo possono essere utilizzati sia talli aplontici che diplonti. Sebbene il genere presenti un complesso ciclo vitale trifasico isomorfo aplo-diplontico, la sporulazione è raramente necessaria, tranne quando è necessario il rinnovamento genetico dei ceppi per ottenere raccolti migliori. In questo caso, sia le tetraspore (spore aplontiche formate dalla meiosi) che le carpospore (spore diplontiche formate dalla mitosi) danno origine a talli macroscopici che possono poi essere cresciuti e propagati per riproduzione vegetativa4. I cicli di crescita sono dettati dalle condizioni ambientali e dallo stato fisiologico degli individui, tra gli altri fattori biologici come l’emergere di epifite e l’adesione di altri organismi. Pertanto, l’ottimizzazione delle condizioni di coltivazione è fondamentale per garantire un’elevata produttività e produrre biomassa di buona qualità5.
L’estrazione di composti bioattivi dalle alghe, tra cui G. gracilis, può essere ottenuta attraverso vari metodi 6,7. La scelta del metodo di estrazione dipende dai composti specifici di interesse, dall’applicazione target e dalle caratteristiche dell’alga. In questo studio, ci siamo concentrati sull’estrazione con solvente, che prevede l’utilizzo di solventi verdi, come acqua o etanolo, per sciogliere ed estrarre composti bioattivi dalla biomassa delle alghe. L’estrazione può essere effettuata tramite macerazione in modo versatile ed efficace e può essere utilizzata per una vasta gamma di composti. Si tratta di un metodo semplice e ampiamente utilizzato che prevede l’immersione della biomassa in un solvente per un periodo prolungato, in genere a temperatura ambiente o leggermente elevata. Il solvente viene mescolato per migliorare il processo di estrazione. Dopo il tempo di estrazione desiderato, il solvente viene separato dal materiale solido mediante filtrazione o centrifugazione.
L’acqua è un solvente comunemente usato nelle applicazioni alimentari grazie alla sua sicurezza, disponibilità e compatibilità con un’ampia gamma di prodotti alimentari. L’estrazione dell’acqua è adatta per composti polari come polisaccaridi, peptidi e alcuni fenolici. Tuttavia, potrebbe non estrarre efficacemente composti non polari. L’etanolo è anche un solvente ampiamente utilizzato nelle applicazioni alimentari e può essere efficace per estrarre una varietà di molecole bioattive, inclusi composti fenolici, flavonoidi e alcuni pigmenti. L’etanolo è generalmente riconosciuto come sicuro per l’uso negli alimenti e può essere facilmente evaporato, lasciando dietro di sé i composti estratti. Vale la pena notare che la scelta del metodo di estrazione dovrebbe considerare fattori come l’efficienza, la selettività, l’economicità e l’impatto ambientale. L’ottimizzazione dei parametri di estrazione, come la concentrazione del solvente, il tempo di estrazione, la temperatura e la pressione, è fondamentale per ottenere rese ottimali di composti bioattivi da G. gracilis o da altre alghe.
È stato riscontrato che le alghe mostrano attività antimicrobica contro un’ampia gamma di microrganismi, tra cui batteri, funghi e virus8. Questa attività è attribuita a componenti bioattivi, tra cui fenolici, polisaccaridi, peptidi e acidi grassi. Diversi studi hanno dimostrato la loro efficacia contro agenti patogeni come Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e Pseudomonas aeruginosa, tra gli altri9. L’attività antimicrobica delle alghe è attribuita alla presenza di composti bioattivi che possono interferire con le pareti cellulari microbiche, le membrane, gli enzimi e le vie di segnalazione10. Questi composti possono interrompere la crescita microbica, inibire la formazione di biofilm e modulare le risposte immunitarie.
Le alghe rosse, note anche come rodofite, sono un gruppo di alghe che possono esibire attività antimicrobica contro una varietà di microrganismi. All’interno di questo gruppo, G. gracilis contiene vari composti bioattivi che possono contribuire alla sua attività antimicrobica segnalata. Mentre le molecole specifiche possono variare, le classi comuni che sono state riportate in G. gracilis e che possono possedere proprietà antimicrobiche sono polisaccaridi, fenolici, terpenoidi e pigmenti11. Tuttavia, è importante notare che la presenza e la quantità di questi componenti possono variare a seconda di fattori come il luogo di raccolta delle alghe, la stagionalità, le condizioni fisiologiche dei talli e le condizioni ambientali. Pertanto, la classe specifica e la concentrazione di composti antimicrobici in G. gracilis possono variare di conseguenza.
È stato anche scoperto che G. gracilis ha proprietà antiossidanti, contenendo vari composti fenolici, che hanno dimostrato di eliminare i radicali liberi e ridurre lo stress ossidativo12.Gli antiossidanti aiutano a proteggere le cellule dai danni causati dalle specie reattive dell’ossigeno e hanno potenziali benefici per la salute. La capacità antiossidante può essere valutata direttamente attraverso diversi metodi, tra cui l’attività di scavenging dei radicali liberi 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH) e, indirettamente, attraverso la quantificazione del contenuto polifenolico totale (TPC)13.
Anche se un ingrediente ha una bioattività prominente, la sua valutazione della citotossicità è indispensabile per valutare le sostanze naturali e sintetiche da utilizzare a contatto con cellule o tessuti viventi. Esistono diversi metodi per misurare la citotossicità, ognuno con vantaggi e limiti. Nel complesso, offrono una serie di opzioni per valutare gli effetti nocivi di molte sostanze sulle cellule e, allo stesso tempo, per studiare i meccanismi del danno e della morte cellulare14.
In questo lavoro, utilizziamo il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), un metodo colorimetrico introdotto da Mosmann (1983)15. Questo metodo misura la riduzione dei sali di tetrazolio a un prodotto di formazano viola da parte di cellule metabolicamente attive. Maggiore è la quantità di cristalli di formazano, maggiore è il numero di cellule vitali, fornendo così una misura indiretta della citotossicità14. Poiché in questo lavoro l’acqua di G. gracilis e gli estratti di etanolo sono destinati ad essere incorporati in formulazioni dermocosmetiche, la valutazione della citotossicità in vitro viene eseguita in una linea cellulare di cheratinociti (HaCaT).
Per quanto riguarda l’applicazione alimentare, le alghe sono generalmente povere di calorie e nutrizionalmente ricche di fibre alimentari, elementi essenziali e aminoacidi, polisaccaridi, acidi grassi polinsaturi, polifenoli e vitamine 2,16. G. gracilis non fa eccezione, avendo un interessante valore nutrizionale. Freitas et al. (2021)4 hanno scoperto che G. gracilis coltivato aveva livelli più elevati di proteine e vitamina C e manteneva il livello di lipidi totali rispetto alle alghe selvatiche. Questo può rappresentare un vantaggio economico e ambientale, in quanto dal punto di vista nutrizionale la produzione è preferibile allo sfruttamento delle risorse selvatiche. Inoltre, i consumatori sono sempre più preoccupati per il tipo di cibo che mangiano, quindi è importante introdurre nuovi ingredienti per l’arricchimento alimentare e utilizzare nuove risorse per ottenere estratti che possano aggiungere valore a un prodotto e rivendicare una “clean label”. Inoltre, il mercato attuale è molto competitivo e richiede lo sviluppo di nuovi prodotti e strategie innovative per differenziare i produttori dai loro concorrenti17.
L’arricchimento di prodotti a basso valore nutrizionale, come la pasta, con risorse marine, tra cui le alghe, è una strategia per introdurre questa risorsa come nuovo alimento e una strategia di differenziazione del mercato attraverso un prodotto con un valore nutrizionale distinto. D’altra parte, G. gracilis è una fonte di pigmenti rossi naturali come le ficobiliproteine18, con un alto potenziale per applicazioni nell’industria alimentare. Quest’alga ha mostrato un grande interesse in diverse aree e la sua applicazione può essere effettuata utilizzando l’alga intera, gli estratti e/o la biomassa rimanente. In questo lavoro, dimostriamo alcuni esempi di tali applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I test di attività antimicrobica in un mezzo liquido sono utilizzati per valutare l’efficacia delle sostanze antimicrobiche contro i microrganismi sospesi in un mezzo liquido e vengono solitamente eseguiti per determinare la capacità di una sostanza di inibire la crescita o uccidere i microrganismi35,36,37,38. Sono utilizzati per valutare la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Portoghese per la Scienza e la Tecnologia (FCT) attraverso i Progetti Strategici concessi al MARE-Centro di Scienze Marine e Ambientali (UIDP/04292/2020 e UIDB/04292/2020) e al Laboratorio Associato ARNET (LA/P/0069/2020). FCT ha inoltre finanziato le borse di dottorato individuali assegnate a Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) e Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente anche dal progetto HP4A – PASTA SANA PER TUTTI (co-promozione n. 039952), cofinanziato dal FESR – Fondo Europeo di Sviluppo Regionale, nell’ambito del Programma Portogallo 2020, attraverso COMPETE 2020 – Programma Operativo Competitività e Internazionalizzazione.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
