Valorisering av Red Seaweed Gracilaria gracilis gjennom en bioraffineri tilnærming

Summary

Her beskriver vi flere protokoller som tar sikte på en integrert valorisering av Gracilaria gracilis: høsting av ville arter, intern vekst og utvinning av bioaktive ingredienser. Ekstraktenes antioksidanter, antimikrobielle og cytotoksiske effekter evalueres, sammen med ernærings- og stabilitetsvurdering av mat beriket med hel tangbiomasse og pigmenter.

Abstract

Interessen for tang og tare som et rikt råstoff for å oppnå verdifulle og multitarget bioaktive ingredienser vokser kontinuerlig. I dette arbeidet undersøker vi potensialet til Gracilaria gracilis, en spiselig rød tang dyrket over hele verden for sin kommersielle interesse som en kilde til agar og andre ingredienser for kosmetiske, farmakologiske, mat og fôrapplikasjoner.

G. gracilis-vekstforholdene ble optimalisert gjennom vegetativ forplantning og sporulering mens man manipulerte de fysisk-kjemiske forholdene for å oppnå en stor biomassebestand. Grønne ekstraksjonsmetoder med etanol og vann ble utført over tangbiomassen. Det bioaktive potensialet til ekstrakter ble vurdert gjennom et sett in vitro-analyser vedrørende deres cytotoksisitet, antioksidanter og antimikrobielle egenskaper. I tillegg ble tørket tangbiomasse inkorporert i pastaformuleringer for å øke matens næringsverdi. Pigmenter ekstrahert fra G. gracilis har også blitt innlemmet i yoghurt som et naturlig fargestoff, og deres stabilitet ble evaluert. Begge produktene ble sendt til takknemlighet for et halvtrent sensorisk panel med sikte på å oppnå den beste endelige formuleringen før de nådde markedet.

Resultatene støtter allsidigheten til G. gracilis enten den brukes som en hel biomasse, ekstrakter og / eller pigmenter. Gjennom implementering av flere optimaliserte protokoller, gjør dette arbeidet det mulig å utvikle produkter med potensial til å tjene mat-, kosmetikk- og akvakulturmarkedene, fremme miljømessig bærekraft og en blå sirkulær økonomi.

Videre, og i tråd med en bioraffineritilnærming, vil den gjenværende tangbiomassen bli brukt som biostimulant for plantevekst eller omdannes til karbonmaterialer som skal brukes i vannrensing av de interne akvakultursystemene til MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

Introduction

Tang og tare kan betraktes som et interessant naturlig råmateriale som skal profitteres av farmasøytiske, mat-, fôr- og miljøsektorer. De biosyntetiserer en rekke molekyler, mange som ikke finnes i terrestriske organismer, med relevante biologiske egenskaper ^1,2. Imidlertid må tangoptimaliserte dyrkingsprotokoller implementeres for å sikre en stor biomassebestand.

Dyrkingsmetoder må alltid ta hensyn til tangens thalli og generell morfologi. Gracilaria gracilis er et klonalt takson, noe som betyr at festeorganet produserer flere vegetative akser. Forplantning ved fragmentering (vegetativ reproduksjon) oppnås dermed, da hver av disse aksene er fullt i stand til å vedta et uavhengig liv fra hovedthallus³. Klonal taxa kan med hell integreres med enkle og raske ett-trinns dyrkingsmetoder, da store mengder biomasse oppnås ved å splitte thallus i små fragmenter som raskt regenererer og vokser til nye, genetisk identiske individer. Både haplontiske og diplontiske thalli kan brukes i denne prosessen. Selv om slekten viser en kompleks haplo-diplontisk isomorf trifasisk livssyklus, er sporulering sjelden nødvendig, bortsett fra når genetisk fornyelse av bestandene er nødvendig for å oppnå forbedrede avlinger. I dette tilfellet gir både tetrasporer (haplontiske sporer dannet av meiose) og karposporer (diplontiske sporer dannet av mitose) opphav til makroskopiske talli som deretter kan dyrkes og forplantes ved vegetativ reproduksjon⁴. Vekstsykluser dikteres av miljøforhold og individets fysiologiske tilstand, blant annet biologiske faktorer som fremveksten av epifytter og adhesjon av andre organismer. Derfor er optimalisering av vekstforhold avgjørende for å sikre høy produktivitet og produsere biomasse av god kvalitet⁵.

Ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra tang, inkludert G. gracilis, kan oppnås ved ulike metoder ^6,7. Valget av ekstraksjonsmetoden avhenger av de spesifikke forbindelsene av interesse, målapplikasjonen og egenskapene til tangen. I denne studien fokuserte vi på løsningsmiddelekstraksjon, som innebærer bruk av grønne løsningsmidler, som vann eller etanol, for å oppløse og trekke ut bioaktive forbindelser fra tangbiomassen. Ekstraksjonen kan utføres gjennom maserasjon på en allsidig og effektiv måte og kan brukes til et bredt spekter av forbindelser. Det er en enkel og mye brukt metode som involverer bløtlegging av biomasse i et løsningsmiddel i en lengre periode, vanligvis ved rom- eller litt forhøyede temperaturer. Oppløsningsvæsken omrøres for å forbedre ekstraksjonsprosessen. Etter ønsket ekstraksjonstid separeres løsningsmidlet fra det faste materialet ved filtrering eller sentrifugering.

Vann er et vanlig løsningsmiddel i næringsmiddelapplikasjoner på grunn av dets sikkerhet, tilgjengelighet og kompatibilitet med et bredt spekter av matvarer. Vannekstraksjon er egnet for polare forbindelser som polysakkarider, peptider og visse fenoler. Det kan imidlertid ikke effektivt trekke ut ikke-polare forbindelser. Etanol er også et mye brukt løsningsmiddel i matapplikasjoner og kan være effektivt for å ekstrahere en rekke bioaktive molekyler, inkludert fenolforbindelser, flavonoider og visse pigmenter. Etanol er generelt anerkjent som trygt for bruk i mat og kan lett fordampes, etterlater de ekstraherte forbindelsene. Det er verdt å merke seg at valg av utvinningsmetode bør ta hensyn til faktorer som effektivitet, selektivitet, kostnadseffektivitet og miljøpåvirkning. Optimalisering av ekstraksjonsparametere, som løsningsmiddelkonsentrasjon, ekstraksjonstid, temperatur og trykk, er avgjørende for å oppnå optimale utbytter av bioaktive forbindelser fra G. gracilis eller andre tang.

Tang har vist seg å vise antimikrobiell aktivitet mot et bredt spekter av mikroorganismer, inkludert bakterier, sopp og virus⁸. Denne aktiviteten tilskrives bioaktive komponenter, inkludert fenoler, polysakkarider, peptider og fettsyrer. Flere studier har vist sin effekt mot patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. og Pseudomonas aeruginosa, blant andre⁹. Den antimikrobielle aktiviteten til tang tilskrives tilstedeværelsen av bioaktive forbindelser som kan forstyrre mikrobielle cellevegger, membraner, enzymer og signalveier¹⁰. Disse forbindelsene kan forstyrre mikrobiell vekst, hemme biofilmdannelse og modulere immunresponser.

Røde tang, også kjent som rhodophytes, er en gruppe alger som kan utvise antimikrobiell aktivitet mot en rekke mikroorganismer. Innenfor denne gruppen inneholder G. gracilis forskjellige bioaktive forbindelser som kan bidra til den rapporterte antimikrobielle aktiviteten. Mens de spesifikke molekylene kan variere, er de vanlige klassene som er rapportert i G. gracilis og kan ha antimikrobielle egenskaper, polysakkarider, fenoler, terpenoider og pigmenter¹¹. Det er imidlertid viktig å merke seg at tilstedeværelsen og mengdene av disse komponentene kan variere avhengig av faktorer som plasseringen av tangsamling, sesongmessighet, fysiologisk tilstand av thalli og miljøforhold. Derfor kan den spesifikke klassen og konsentrasjonen av antimikrobielle forbindelser i G. gracilis variere tilsvarende.

G. gracilis har også blitt funnet å holde antioksidantegenskaper, som inneholder forskjellige fenolforbindelser, som har vist seg å scavenge frie radikaler og redusere oksidativt stress¹².Antioksidanter bidrar til å beskytte celler mot skade forårsaket av reaktive oksygenarter og har potensielle helsemessige fordeler. Antioksidantkapasiteten kan evalueres direkte gjennom forskjellige metoder, inkludert 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) renseaktivitet for frie radikaler og indirekte gjennom kvantifisering av totalt polyfenolisk innhold (TPC)¹³.

Selv om en ingrediens er rapportert å ha en fremtredende bioaktivitet, er cytotoksisitetsvurderingen uunnværlig for å vurdere naturlige og syntetiske stoffer som skal brukes i kontakt med levende celler eller vev. Det finnes flere metoder for måling av cytotoksisitet, hver med fordeler og begrensninger. Samlet sett tilbyr de en rekke alternativer for å evaluere de skadelige effektene av mange stoffer på celler og samtidig undersøke mekanismene for celleskader og død¹⁴.

I dette arbeidet bruker vi 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen, en kolorimetrisk metode introdusert av Mosmann (1983)¹⁵. Denne metoden måler reduksjonen av tetrazoliumsalter til et lilla formazanprodukt av metabolsk aktive celler. Jo høyere mengden formazankrystaller, desto høyere er antall levedyktige celler, og gir dermed et indirekte mål for cytotoksisitet¹⁴. Siden G. gracilis vann- og etanolekstrakter i dette arbeidet er ment å bli inkorporert i dermo-kosmetiske formuleringer, utføres in vitro cytotoksisitetsevalueringen i en keratinocytt (HaCaT) cellelinje.

Når det gjelder matapplikasjonen, er tang generelt lavt i kalorier og ernæringsmessig rik på kostfibre, essensielle elementer og aminosyrer, polysakkarider, flerumettede fettsyrer, polyfenoler og vitaminer ^2,16. G. gracilis er ikke noe unntak, og har en interessant næringsverdi. Freitas et al. (2021)⁴ fant at dyrket G. gracilis hadde høyere nivåer av protein og vitamin C og opprettholdt nivået av totale lipider sammenlignet med vill tang. Dette kan representere en økonomisk og miljømessig fordel, da næringsmessig sett er produksjon å foretrekke fremfor utnyttelse av ville ressurser. I tillegg er forbrukerne i økende grad opptatt av hvilken type mat de spiser, så det er viktig å introdusere nye ingredienser for matberikelse og bruke nye ressurser for å skaffe ekstrakter som kan tilføre verdi til et produkt og kreve en “ren etikett.” Dessuten er dagens marked svært konkurransedyktig, og krever utvikling av nye produkter og innovative strategier for å skille produsenter fra sine konkurrenter¹⁷.

Berikelse av produkter med dårlig næringsverdi, som pasta, med marine ressurser, inkludert tang, er en strategi for å introdusere denne ressursen som en ny matvare og en markedsdifferensieringsstrategi gjennom et produkt med tydelig næringsverdi. På den annen side er G. gracilis en kilde til naturlige røde pigmenter som phycobiliproteins¹⁸, som har stort potensial for applikasjoner i næringsmiddelindustrien. Denne tangen har vist stor interesse på flere områder, og anvendelsen kan gjøres ved hjelp av hele tangen, ekstrakter og/eller den gjenværende biomassen. I dette arbeidet viser vi noen eksempler på slike applikasjoner.

Protocol

1. Biomasse høsting og forberedelse Høst prøvene av G. gracilis under lavvann og transporter dem raskt til laboratoriet i mørke, avkjølte bokser for å unngå tørking, lys og lufteksponering. I laboratoriet, vask hver tallus med rennende sjøvann og rengjør grundig for å fjerne rusk, nekrotiske deler, epifytter og andre organismer fra overflaten. Oppbevar villbiomassen i konstant luftet sjøvann (31-35 psu) i et klimarom (20 ± 1 °C) med lav innstråling fra dagslys, kjøli…

Representative Results

Antimikrobiell aktivitet Ved tolkning av de oppnådde resultatene bør man huske på at jo høyere prosentandel av inhibering, desto større er effekten av ekstraktet ved å hemme veksten av den spesifikke stammen, og følgelig jo mer interessant ekstraktet er som et antimikrobielt middel. Gjennom denne metodikken kan vi raskt identifisere hvilke ekstrakter som har større aktivitet på visse bakteriestammer, og…

Discussion

De antimikrobielle aktivitetstestene i et flytende medium brukes til å evaluere effektiviteten av antimikrobielle stoffer mot mikroorganismer suspendert i et flytende medium og utføres vanligvis for å bestemme et stoffs evne til å hemme vekst eller drepe mikroorganismer^35,36,37,38. De brukes til å evaluere mikroorganismers følsomhet overfor antimikrobielle midler og utføres i reagensrør…

Materials

Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9